lncRNA在細胞自噬調控中作用的研究進展

陳俊宇，龔向前,2，張愛青,2

(1 南京醫科大學第二臨床醫學院，南京210011；2 南京醫科大學第二附屬醫院)

細胞自噬是一種在進化水平上高度保守的細胞內成分自我降解的過程，對于維持細胞結構和功能穩態具有重要作用[1]。在疾病發生前，細胞自噬通過清除進入細胞內的損傷因子，防止細胞受損；在疾病發生早期，細胞自噬能直接誘導受損細胞死亡，抑制或延緩疾病發展；但當疾病發展至中晚期時，過度激活的細胞自噬可降解細胞正常結構，反而使病情惡化。細胞自噬調控可通過激活自噬相關基因(ATG)啟動子、調節轉錄因子、改變相關蛋白激酶ULK1/2活性等多種方式實現。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸序列的非編碼RNA，由于缺乏蛋白質編碼功能，最初被認為是基因轉錄過程中的“噪音”，在很長的一段時間內未得到足夠重視。近年研究發現，lncRNA具有較長的堿基序列，擁有多個功能區域，其特異性表達往往能參與多種分子信號通路，發揮不同的生理調控功能，其在細胞自噬調控中存在抑制、促進和雙向調控細胞自噬三種作用[2]。本文結合文獻對lncRNA在細胞自噬調控中作用的研究進展作一綜述。

1 lncRNA概述

分子生物學的中心法則認為，遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質，從而完成遺傳信息的轉錄和翻譯過程。人類基因組只有20% DNA用于編碼蛋白質，其余轉錄成RNA，但不被翻譯成蛋白質，這類不編碼任何蛋白質的RNA被稱為非編碼RNA，其中長度>200個核苷酸的為lncRNA[3]。迄今為止，在人類基因組中發現的lncRNA已超過1×106個。在過去很長的一段時間內，人們普遍認為lncRNA缺乏蛋白質編碼能力，是轉錄過程中的無功能副產物。目前認為，lncRNA作為人類基因組中一類重要的調控分子發揮相應生物學功能。Sun[4]研究發現，lncRNA不僅能夠通過堿基配對來介導目標識別，還能在三維結構層面上與DNA、RNA和蛋白質結合，從而組成更復雜的調控網絡。lncRNA既可作為信號分子或誘餌分子，參與調控基因的表達與轉錄，還可作為引導分子或支架分子，影響蛋白質分子的功能與穩定。

2 lncRNA在細胞自噬調控中的作用

細胞自噬主要分為激活啟動、游離膜形成自噬體、自噬體與溶酶體融合、降解四個階段。細胞自噬啟動依賴于增多的應激因子(如活性氧、鈣離子等)刺激胞內能量感受器[如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、AMP激活蛋白激酶等]，干預應激因子表達或直接調節能量感受器狀態，從啟動階段調控細胞自噬。其余三個階段依賴于各種自噬相關基因轉錄和翻譯過程中產生的蛋白作用原件，如招募游離膜聚集的Beclin 1、伸長游離膜形成自噬體的ATG8-磷脂酰乙醇胺及幫助其他自噬蛋白定位的Ⅲ類PI3K復合物，通過激活基因啟動子或結合轉錄因子，抑制相關基因表達、增強蛋白質穩定性、抑制蛋白質磷酸化等，實現對細胞自噬調控[5]。lncRNA能調節自噬相關的DNA、RNA或蛋白質的功能與活性，或影響自噬相關的應激因子與能量感受器，從而參與細胞自噬的調節。目前認為，參與細胞自噬調控的lncRNA可分為三類，即抑制細胞自噬的尿路上皮癌胚抗原(UCA1)、心肌自噬抑制因子(CAIF)、HAGLROS等；促進細胞自噬的轉移相關肺腺癌轉錄本1(MALAT1)、肝癌高表達轉錄本(HULC)、HOX轉錄反義RNA(HOTAIR)、SOX2OT變體7(SOX2OT-V7)等；雙向調控自噬的lncRNA H19、母系表達基因3(MEG3)等。

2.1 抑制細胞自噬的lncRNA Liu等[6]通過生物信息學方法篩選出多種與自噬高度相關的lncRNA，部分lncRNA表達可明顯抑制細胞自噬現象，二者呈負相關關系。說明這些lncRNA具有抑制細胞自噬的作用。常見抑制細胞自噬的lncRNA有UCA1、CAIF、HAGLROS等。

UCA1最早是從人類膀胱癌中發現的lncRNA，定位于人類19號染色體13區，包含三個外顯子[7]。在各種惡性腫瘤細胞中，UCA1可與miRNA相互作用，調節腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。近期研究發現，UCA1還能通過與miR-184競爭性結合，促進能抑制細胞自噬的生長抑制因子1(osgin1)表達，發揮抑制細胞自噬作用。Gao等[8]研究發現，在高濃度砷刺激下的人肝細胞中，自噬體膜標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)表達明顯升高，細胞自噬作用增強，且UCA1表達明顯降低；而UCA1高表達則可抑制砷刺激所引起的細胞自噬性死亡。表明UCA1可能是一種抑制細胞自噬的lncRNA。通過高表達UCA1篩選其可能相關的下游候補基因，發現氧化應激誘導的osgin1在RNA測序中最敏感。之后通過生物信息學分析發現，UCA1與miR-184、osgin1三者的結合位點相同，提示UCA1調控細胞自噬的通路可能與miR-184、osgin1有關。最近研究證實，miR-184可通過與osgin1的3′端非翻譯區結合而促進osgin1表達；UCA1可通過競爭性內源性RNA抑制miR-184表達，從而調節osgin1表達并抑制細胞自噬。

CAIF是Liu等[9]在心肌細胞研究中發現的一種lncRNA。在心肌細胞中，CAIF可通過降低心肌素(Myocardin)表達而抑制自噬囊泡聚集，繼而抑制細胞自噬。研究發現，在H2O2誘導心肌細胞自噬的過程中，Myocardin表達顯著增加，Myocardin敲除可明顯降低H2O2誘導的心肌細胞自噬，而Myocardin過表達則可明顯增強心肌細胞自噬囊泡聚集。對Myocardin啟動子區域分析發現，Myocardin啟動子區域存在潛在的p53結合位點。在正常心肌細胞中p53能與Myocardin的啟動子結合，在H2O2處理后的心肌細胞中p53與Myocardin啟動子的結合能力明顯增強。p53在細胞自噬調控中處于Myocardin上游，并通過結合啟動子激活Myocardin表達，從而介導由氧化應激誘發的心肌細胞自噬。最近研究發現，CAIF的3′末端區域能與p53蛋白直接綁定結合，綁定結合后p53蛋白激活Myocardin啟動子能力受到明顯抑制，通過CAIF/p53/Myocardin途徑降低細胞自噬水平。

HAGLROS是一個長度為699 bp的lncRNA(NCBI參考序列：nr_110457.1)，僅有一個轉錄本[10]。有研究發現，胃癌組織HAGLROS高表達，且其表達變化與患者預后不良有關。Chen等[11]研究發現，HAGLROS能被轉錄因子STAT3激活而上調表達，其啟動子區域的E2結合位點能夠與STAT3結合。進一步研究發現，HAGLROS可通過mTOR信號途徑抑制細胞自噬，從而促進腫瘤的發生和進展。生物信息學研究發現，HAGLROS可與miR-100-5p結合。miR-100-5p已被證實可引起mTOR mRNA降解，通過降低mTOR蛋白表達進而促進細胞自噬。由此推測，HAGLROS可能以miR-100-5p為下游目標調控mTOR通路。但過表達miR-100-5p并不能完全逆轉HAGLROS對mTOR表達的促進作用，表明可能還存在其他調控方式。研究發現，HAGLROS還能與mTORC1元件互動形成穩定的復雜結構，激活mTORC1信號通路，抑制細胞自噬。因此，HAGLROS抑制細胞自噬過程中調節mTOR信號主要通過兩種方式，一是競爭性對抗miR-100-5p誘發的mTOR減少，二是與mTORC1元件直接結合，激活mTORC1信號通路。

2.2 促進細胞自噬的lncRNA 有研究發現，某些lncRNA表達與細胞自噬呈正相關關系[12]，表明細胞內還存在促進細胞自噬的lncRNA。目前已發現的可促進細胞自噬的lncRNA有MALAT1、HULC、HOTAIR、SOX2OT-V7等。

MALAT1是一個高度保守的核內lncRNA，定于人類11號染色體1區3帶[13]。MALAT1最初是在對人類非小細胞肺癌轉移相關基因研究中發現的，可在多種腫瘤組織中高表達，與腫瘤的發生、發展密切相關。近年發現，MALAT1還與細胞自噬調控有關。Yuan等[14]研究發現，在肝癌細胞中MALAT1可與組蛋白復合物相互作用，作為競爭性內源RNA，發揮miRNA分子“海綿體”的作用，結合自噬調控因子miR-216b并抑制其表達，從而促進細胞自噬。YiRen等[15]研究發現，在自噬相關耐藥的胃癌細胞中MALAT1高表達，而敲除MALAT1后，ATG12 mRNA表達明顯降低，推測MALAT1在胃癌細胞中存在與ATG12有關的自噬調控路徑；生物信息學分析發現，發揮分子“海綿體”作用的MALAT1與miR-23b-3p結合，可改善miR-23b-3p對ATG12表達的抑制作用，從而促進細胞自噬。Guo等[16]提出了MALAT1/miR-30a/Beclin 1自噬調節網絡，其中miR-30a直接靶向抑制Beclin 1刺激自噬前體產生，MALAT1則作為“海綿體”負向調節miR-30a表達，從而促進細胞自噬。Huang等[17]研究發現，MALAT1還可通過直接抑制miR-124介導STX17表達，從而促進視網膜母細胞瘤細胞自噬，其作用機制可能也與MALAT1的“海綿體”作用有關。

HULC是第一個從人肝癌組織中鑒定出來的特異性lncRNA，其基因序列定位于人類第6號染色體2區4帶3亞帶[18]。研究發現，HULC可通過轉錄抑制和表觀遺傳實現抑制SIRT1蛋白泛素化及ATG7蛋白表達，從而發揮促進細胞自噬作用。Xiong等[19]在HULC對肝癌細胞耐藥性影響的研究中發現，過表達或沉默HULC雖無法影響SIRT1 mRNA表達，卻能顯著影響SIRT1蛋白表達。以往研究證實，SIRT1能通過多種途徑促進細胞自噬。以此切入分析HULC促進肝癌細胞自噬的調控機制，發現了HULC-(miR-6825-5p，miR-6845-5p，miR-6886-3p)-USP22-SIRT1的自噬調控網絡。證實過表達HULC不僅能抑制SIRT1泛素化，還能上調USP22蛋白表達，提高SIRT1蛋白穩定性。同時還發現，HULC促進USP22蛋白表達是通過抑制miR-6825-5p、miR-6845-5p、miR-6886-3p表達實現的。Chen等[20]研究發現，HULC過表達能降低上皮性卵巢癌細胞中ATG7、LC3-Ⅱ表達并誘導p62表達，繼而抑制細胞自噬。鑒于轉染HULC干擾RNA處理或ATG7共轉染HULC處理均能誘導細胞形成自噬體并高表達ATG7，推測HULC還能通過靶向抑制ATG7蛋白表達來誘導卵巢癌細胞自噬的發生。

HOTAIR是首個以反式轉錄方式調控基因表達的lncRNA，其基因序列定位于人類12號染色體1區3帶的HOX基因C位點上，是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的HOXC基因的反義鏈[21]。HOTAIR通過由許多莖環結構組成的復雜二級結構，參與組蛋白修飾并沉默目的基因表達，從而發揮反式調控功能。近年研究發現，HOTAIR通過參與ULK1磷酸化，沉默某些miRNA表達，從而實現促進細胞自噬。在細胞自噬過程中，ULK1通過磷酸化形成p-ULK1而被激活，調節下游ATG9等自噬相關基因，繼而參與自噬小體形成，以啟動細胞自噬。而沉默HOTAIR表達則可抑制p-ULK1，繼而抑制細胞自噬。HOTAIR通過在miR-454-3p基因啟動子區域招募EZH2和DNMT1，導致miR-454-3pDNA甲基化，使得miR-454-3p表達明顯降低，從而負向調控miR-454-3p。在下調HOTAIR后miR-454-3p表達明顯升高，并能觀察到細胞自噬明顯受到抑制。進一步通過生物信息學軟件預測和分析發現，miR-454-3p通過靶向抑制STAT3和ATG12表達而抑制細胞自噬。證實HOTAIR通過沉默miR-454-3p表達并靶向調節STAT3、ATG12，繼而發揮促進細胞自噬作用。

SOX2OT-V7是近期發現與細胞自噬調控有關的lncRNA，是人類SOX2OT基因的一種轉錄變異體[22]。SOX2OT-V7可能在Notch3/DLL3信號通路中扮演下游信號分子的角色，并發揮促進細胞自噬作用。Wang等[23]研究發現，EGCG聯合阿霉素可使骨肉瘤細胞自噬增加，并誘導細胞凋亡，繼而抑制骨肉瘤生長；進一步研究發現，二者可通過抑制Notch3/DLL3信號通路，促進SOX2OT-V7表達上調，繼而靶向調控細胞自噬。證實在骨肉瘤細胞中SOX2OT-V7過表達可促進細胞自噬，并受到Notch3/DLL3通路的靶向調節。但作為一個新發現與自噬調控有關的lncRNA，SOX2OT-V7誘導細胞自噬的具體機制尚不完全清楚，有待進一步研究。

2.3 雙向調控細胞自噬的lncRNA lncRNA具有多個功能區域，能夠與蛋白質結合形成新的功能結合位點，這為lncRNA雙向調控細胞自噬作用提供了可能[24]。目前已發現的具有雙向調控細胞自噬作用的lncRNA有lncRNA H19、MEG3等，這些lncRNA在腫瘤研究領域較為常見，可發揮致癌與抑癌雙重作用[25]。

lncRNA H19是最早發現的印記基因，為父系基因印記、母系基因表達，基因序列定位于人類11號染色體1區5帶5亞帶處[26]。近期研究發現，lncRNA H19具有雙向調控細胞自噬作用，可通過沉默DIRAS3表達抑制細胞自噬，還可通過增強Beclin 1表達或抑制mTOR磷酸化促進細胞自噬。Zhuo等[27]研究發現，在高糖培養的心肌細胞模型中，敲除lncRNA H19可降低EZH2表達并激活DIRAS3啟動子；而過表達lncRNA H19則可降低DIRAS3表達，促進高糖暴露心肌細胞的mTOR磷酸化，進而抑制細胞自噬激活。而近期研究發現，lncRNA H19還能通過其他不同的機制發揮促進細胞自噬作用。Wang等[28]研究認為，lncRNA H19促進細胞自噬作用是通過激活自噬體形成而不是通過抑制自噬體降解實現的。當加入lncRNA H19抑制劑后，除能降低細胞自噬外，還發現DUSP5表達上調；而添加DUSP5 siRNA可解除lncRNA H19抑制劑對細胞自噬的抑制作用，表明DUSP5在細胞自噬調控過程中可能作為lncRNA H19的下游目標。DUSP5-ERK1/2軸是一個新的細胞自噬調控通路。有研究表明，DUSP5-ERK1/2軸存在于lncRNA H19激活的細胞自噬過程中。lncRNA H19可抑制下游目標DUSP5，逆轉DUSP5對ERK1/2的抑制作用。Xu等[29]研究表明，lncRNA H19對細胞自噬還具有促進作用，lncRNA H19高表達能激活PI3K/Akt通路，降低mTOR磷酸化，通過抑制mTOR通路促進細胞自噬。

MEG3是由位于人類14號染色體3區2帶3亞帶上的DLK1-MEG3基因印跡區域轉錄而來[30]。有研究發現，MEG3在膀胱癌、肺癌及神經膠質瘤細胞中具有抑制細胞自噬作用[31]，其作用主要通過直接與ATG17蛋白結合，影響ATG1-ATG13-ATG17蛋白復合體形成而實現。最近研究發現，MEG3能直接作用于ATG3蛋白而發揮促進細胞自噬作用。Xiu等[32]研究發現，MEG3能參與卵巢癌細胞自噬過程，其作用機制可能通過調控ATG3蛋白表達來實現。ATG3殘基側鏈已被證實在LC3脂化中發揮重要作用，可參與自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體過程，繼而促進細胞自噬，故MEG3表達上調可能通過與ATG3蛋白的相互作用形成復合體來誘導細胞自噬，從而抑制腫瘤的發生、進展。另外，MEG3過表達還能穩定ATG3 mRNA以及抑制放線菌素D對ATG3 mRNA的降解作用，繼而促進細胞自噬，但其具體作用機制尚不明確。

綜上所述，多種lncRNA能參與細胞自噬的調控，在疾病發生前或發生早期，細胞自噬有利于清除損傷因子，延緩或抑制疾病發展,而到疾病中晚期，細胞自噬被廣泛激活可使病情惡化。因此，根據疾病發展將細胞自噬動態調控到合理水平有望成為一種新的治療手段，擁有不同調控作用的lncRNA數量與種類豐富，既有抑制或促進細胞自噬的lncRNA，也有雙向調控細胞自噬作用的lncRNA，或許能滿足這種需求。隨著lncRNA研究的不斷深入，一些新的自噬調控相關lncRNA不斷被發現，其調控細胞自噬的作用機制逐漸清晰，這些lncRNA有望通過調控細胞自噬作用成為多種疾病預防與治療的新靶點。