腦梗死和短暫性腦缺血患者腸道菌群、血清載脂蛋白E水平變化及其相關性

朱冬辰，朱彧，牛文彥

(1天津醫科大學免疫學系，天津 300070；2天津市環湖醫院/天津市腦血管與神經變性重點實驗室；3天津醫科大學代謝病醫院)

腦梗死是一種致殘率及病死率較高的疾病[1]。短暫性腦缺血發作被認為是腦梗死的先兆[2]。人體腸道微生態已被證明參與多種生理和病理過程，在心血管疾病中發揮重要作用[3]。腦梗死的發生發展與人體脂代謝紊亂具有密切聯系[4]。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是血脂的重要組成部分，參與動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、心臟病以及高血脂等疾病過程，其血清水平與腦血管疾病發生發展密切相關[5]。有研究[6，7]發現，腸道菌群結構和腸道功能紊亂可引起ApoE表達的增加，進而導致某些疾病的發生發展。但是，短暫性腦缺血和腦梗死患者腸道菌群微生物相對豐度、群落結構、微生物豐富程度的變化及其與ApoE表達的關系尚不清楚。本研究觀察了腦梗死和短暫性腦缺血患者腸道菌群變化，并分析及其與血清ApoE水平的相關性，探討腸道菌群紊亂與腦部缺血性疾病的關系，為腦血管疾病的發病機制研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究選取2015年5月～2017年10月天津市環湖醫院收治的經頭部CT檢查確診的腦梗死患者30例(腦梗死組)、短暫性腦缺血患者30例(短暫性腦缺血組)以及同期體檢健康者30例(健康組)為研究對象。納入標準：腦梗死組、短暫性腦缺血組均符合全國第四屆腦血管病學術會議制定的診斷標準，并經頭部CT檢查確診。健康組經體檢證實無心腦血管疾病和血脂異常。排除標準：所有研究對象排除嚴重心肝腎功能不全者，排除近4周內接受降脂治療者，排除全身感染性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統疾病以及其他系統血栓栓塞性疾病患者。研究對象年齡39～75歲，平均60.8歲，各組間性別和年齡有可比性(P均>0.05)。腦梗死組、短暫性腦缺血組發病24 h內留取糞便標本、血清標本，健康組統一留取糞便標本、血清標本。

1.2 主要試劑與儀器 糞便基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒(美國Illumina公司)，ApoE酶聯免疫(ELISA)試劑盒(美國Abcam公司)，NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀(美國賽默飛世爾科技公司)，MK3型酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司)，120C離心機(北京白洋淀醫療器械有限公司)。

1.3 糞便菌群檢測分析 取研究對象500 mg 中段糞便，采用糞便基因組提取試劑盒提取總RNA并對細菌16S rRNA基因V4可變區進行PCR擴增，V4上游引物5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、下游引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR條件為94 ℃變性2 min，94 ℃、 30 s，52 ℃、 30 s，72 ℃、 45 s，共30個循環，72 ℃延伸5 min。采用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行基因組文庫構建，通過HiSeq2500 PE250平臺對細菌rRNA基因V4可變區進行測序，通過各樣品測序數據對細菌物種間的親緣關系和物種間的差異進行分析，獲得細菌分類、細菌相對豐度(微生物相對豐度即一個樣品里某一微生物種占所有微生物種的比例。根據生物的形態結構和生理功能可將生物劃分為界、門、綱、目、科、屬、種不同的等級)和細菌群落相互關系等信息。文庫構建和測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4 血清ApoE檢測 血清ApoE檢測采用ELISA法，酶標儀(吸收波長492 nm)記錄光密度值(OD值)，根據OD值繪制標準曲線，根據標準曲線求出樣本中ApoE的濃度。

2 結果

2.1 三組腸道菌群在門水平上最大相對豐度、群落結構(各組每個樣本細菌種類和豐度)異質性和物種豐富程度比較 三組腸道菌群在門水平上最大相對豐度排前9位的依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門、軟壁菌門、放線菌門、藍藻門、互養菌門和浮霉菌門，其相對豐度腦梗死組分別為0.423 2±0.219 3、0.298 9±0.124 1、0.238 4±0.113 8、0.001 4±0.000 8、0.011 2±0.008 1、0.021 5±0.002 4、0.001 0±0.000 2、0.000 2±0.000 1、0.000 1±0.000 0，短暫性腦缺血組分別為0.300 6±0.186 9、0.272 8±0.181 7、0.311 1±0.047 8、0.002 4±0.001 0、0.057 6±0.007 1、0.045 8±0.002 4、0.006 2±0.000 5、0.000 2±0.000 1、0.001 4±0.001 0，健康組分別為0.344 2±0.127 9、0.225 4±0.167 9、0.349 0±0.141 6、0.025 3±0.005 2、0.010 5±0.003 9、0.026 5±0.001 2、0.012 0±0.007 2、0.001 1±0.000 9、0.003 1±0.001 2；腦梗死組的擬桿菌門、疣微菌門、放線菌門、藍藻門、互養菌門、浮霉菌門菌群相對豐度與健康組相比，P均<0.05；短暫性腦缺血組的疣微菌門、軟壁菌門、放線菌門、藍藻門、互養菌門、浮霉菌門菌群相對豐度與健康組相比，P均<0.05；腦梗死組的厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、軟壁菌門、放線菌門、藍藻門、浮霉菌門菌群相對豐度與短暫性腦缺血組相比，P均<0.05。

NMDS分析發現，健康組和腦梗死組腸道菌群群落結構異質性(脅迫系數stress<0.05，P<0.05)高于短暫性腦缺血組和健康組腸道菌群群落結構的異質性(脅迫系數stress>0.05，P>0.05)。

腦梗死組、短暫性腦缺血組、健康組腸道菌群的物種豐富程度即Chao1指數分別為591.775 5±198.472 2、778.844 5±71.197 9、799.345 5±69.689 0；腦梗死組與短暫性腦缺血組和健康組相比,P均<0.05；短暫腦缺血組與健康組相比，P>0.05。

2.2 三組血清中ApoE水平比較 腦梗死組、短暫性腦缺血組、健康組血清ApoE水平分別為(36.2±6.3) 、(33.2±5.4)、(32.8±5.7)mg/L；腦梗死組與短暫腦缺血組和健康組相比,P均<0.05；短暫腦缺血組與健康組相比，P>0.05。

2.3 三組在門水平上最大相對豐度排前9位的腸道菌群相對豐度與血清ApoE水平的相關性 三組擬桿菌門相對豐度與血清ApoE水平呈負相關(r=-0.606 8，P<0.05)，其他8種腸道菌群相對豐度與ApoE水平無顯著相關性(r=0.3，P>0.05)。

3 討論

腦梗死是一種腦血管循環障礙性疾病，短暫性腦缺血發作是由于短暫性腦血管血液供應不足引起的局灶性腦缺血，被認為是腦梗死的早期表現[8，9]。腦梗死和短暫性腦缺血等腦部缺血性疾病的發病和進展機制尚未完全清楚。

人體腸道菌群對維持人體的健康具有重要作用[10，11]。本研究發現，腦梗死和短暫性腦缺血患者腸道菌群主要微生物相對豐度、群落結構以及物種豐富程度均發生了一定變化。推測這一變化可能在腦血管疾病發生發展過程中扮演著重要角色，可能是腦部缺血性疾病的潛在致病因素[12]。

NMDS分析發現，腦梗死組與健康組腸道菌群的群落結構差異顯著，同時腦梗死組腸道菌群多樣性顯著低于健康組，而短暫性腦缺血組和健康組腸道菌群多樣性未見顯著差異。上述結果表明腸道菌群的變化可能與腦缺血程度有關，進一步證實腸道菌群與腦部缺血性疾病的潛在聯系[13]。ApoE是腦部缺血性疾病的獨立風險因素之一，也是腸道菌群影響腦缺血和腦梗死發病過程的重要機制[14]。本研究也發現，短暫性腦缺血組和腦梗死組血清ApoE水平顯著高于健康組，與文獻[15]報道一致。已有研究[16]發現腸道微生態失調可導致人體代謝的紊亂。擬桿菌門是人體腸道菌群的主要組成之一，可受到遺傳、年齡、飲食、疾病和藥物等因素影響，具有調控人體脂代謝的功能[17]。本研究發現，擬桿菌門在腦梗死組患者糞便中相對豐度顯著下調且下調水平高于短暫性腦缺血組，即擬桿菌門相對豐度與腦缺血程度有關。本研究還發現，健康組、短暫性腦缺血組和腦梗死組腸道菌群中擬桿菌門相對豐度與血清ApoE水平成負相關，而其他主要微生物種類與血清ApoE水平無顯著相關性。因此，我們認為擬桿菌門可能通過調節ApoE代謝影響腦部缺血性疾病的發生發展。

對正常無菌小鼠喂食帕金森等患者腸道菌群可導致小鼠神經細胞發生改變，證明腸道菌群可以通過多種因素誘導疾病的發生[18]。根據本研究結果，也可以推測腦梗死患者飲食、代謝和其他原因導致了腸道微生態的改變，同時腸道微生態的改變也通過代謝等因素誘發或加重了腦缺血和腦梗死的發生或發展，形成正反饋，這需要在今后的研究中進一步證實。