肺纖維化體外模型建立方法的研究進展

衛楊林，殷子斐，李霞

(1上海中醫藥大學，上海201203；2第二軍醫大學長海醫院)

肺纖維化是一類慢性進行性加重疾病，可導致患者的肺功能逐漸惡化。其實質是肺泡損傷，肺組織過度修復、重塑的過程，肺臟組織實質細胞減少，纖維結締組織異常增多的疾病。肺纖維化患者的中位生存期僅2～5年，5年存活率只有20%[1]。目前臨床上常用的治療方法雖然有戒煙、氧療、機械通氣等非藥物治療方法，以及吡非尼酮、尼達尼布、N-乙酰半胱氨酸等抗纖維化、抗氧化藥物，但療效欠佳[2]。肺移植是肺纖維化終末期的惟一治療途徑，能提高患者生存率，但畢竟供體有限，且治療費用昂貴，難以惠及更多患者。因此，積極深入開展肺纖維化的相關研究，提高肺纖維化的診斷和治療水平迫在眉睫。與體內研究相比，體外研究具有簡便迅速、條件易控制等優點，在疾病研究和藥物研發中應用較廣。目前，肺纖維化的體外研究主要是結合肺纖維化的病因和發病機制，對細胞系進行適當干預，模擬肺纖維化的病理過程。因細胞種類、干預方式的不同，目前有多種關于肺纖維化體外模型的建立方法。現就近年來應用較為廣泛的肺纖維化的體外模型的建立方法進行系統綜述。

1　病因刺激造模法

隨著對肺纖維化研究的深入，現已證實部分肺纖維化的發生有一定的病因，大多數由于外界物質的接觸所導致，如暴露于藥物、塵埃、化學試劑等。因此，可以利用這些病因作為細胞模型的誘導劑，建立肺纖維化的體外模型。

1.1博來霉素(BLM)BLM是一種抗腫瘤藥物，但可導致細胞外基質(ECM)沉積和炎性反應，促進肺纖維化形成，常用來作為動物肺纖維化模型的誘導劑[3]。Della Latta等[4]取少量肺組織經消化得到的原代肺纖維細胞，用不同濃度范圍BLM(0～3.5 μg/mL)刺激4 h后，發現原代肺纖維細胞中血管炎癥標志物穿透素3和TNF-α mRNA表達量均增加。Huang等[5]用BLM(3 mU/mL)刺激人肺成纖維細胞24、48、72 h后，發現TGF-β1mRNA表達量分別是空白組的60、40、20倍；而預先用TGF-β1抗體處理1 h后再給予BLM刺激，發現此時纖連蛋白(FN)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的蛋白和基因水平與空白組基本相同。

1.2百草枯(PQ) PQ是一種高毒性除草劑，肺是其作用的主要靶器官，表現為急性肺泡炎和肺間質纖維化的迅速形成，從而能誘導人和動物形成肺纖維化疾病，其主要是通過上皮-間質轉化(EMT)引起的，并且有TGF-β/Smad信號通路的參與[6]。高燁等[7]將PQ(50 μmol/L)與人肺上皮細胞HPAEpiC共同孵育24 h后，發現細胞從鵝卵石樣上皮形態轉變為間質樣梭形形態，上皮性標志物E-cadherin蛋白的表達下調，而間質性標記物N鈣黏著蛋白(N-cadherin)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和Vimentin mRNA表達量均增加。

1.3二氧化硅(SiO2) SiO2粉塵是一種工業粉塵，長期吸入會造成嚴重的肺損傷。當肺中巨噬細胞吞噬大量粉塵后，會分泌相關活性因子，產生其他炎癥反應促進矽肺的形成。Liang等[8]先用SiO2(250 μg/mL)刺激小鼠巨噬細胞細胞RAW264.7，24 h后用其上清液來培養肺泡Ⅱ型上皮細胞RLE-6TN，24 h后檢測發現E-cadherin蛋白表達下調了60%，而Vimentin、FN和Ⅰ型膠原(ColⅠ)蛋白表達都明顯上調，分別升高了1.2、1.2、1.3倍；同時也發現細胞遷移活性增強，表現出纖維母細胞樣形態。郝小惠等[9]用SiO2(50 μg/mL)混懸液刺激人肺腺癌細胞A549細胞，結果顯示水通道蛋-1(AQP-1)mRNA在2 h達到高峰(為空白組的3.85倍)；AQP-1蛋白表達也上調并在6 h時達到峰值。

1.4 碳納米管(CNT) CNT是一種新型碳質納米材料，可分為單壁碳納米管(SWCNT)和多壁碳納米管(MWCNT)，對體內的毒性主要為肺部炎癥和纖維化。肺內CNT的持續存在會發起一種早期炎癥反應，其特征是產生趨化因子誘導肺纖維細胞的慢性活化，分泌成纖維的生長因子如轉化生長因子β1(TGF-β1)、血小板源性生長因子(PDGF)，加重ECM(主要為膠原蛋白、纖維蛋白)沉積，導致漸進性纖維化[10]。Wang等[11]用MWCNT(15～60 μg/mL)刺激鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3，48 h后檢測發現細胞特異性蛋白-1(FSP-1)、α-SMA和Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)蛋白均有上升趨勢，并呈劑量依賴；劑量為30 μg/mL時成纖維細胞特異性蛋白1(FSP-1)、α-SMA、Col Ⅲ mRNA表達量分別是空白組的2、2.5、2.2倍。

1.5粉塵螨粉塵螨粗提物是體外過敏原刺激物，能夠誘發肺上皮細胞和巨噬細胞分泌炎癥相關因子，如IL-6等誘導肺纖維化的形成。已有研究[12]發現，IL-6在纖維結締組織和平滑肌增生過程中發揮重要的作用，可促進膠原蛋白聚集和成纖維細胞的增殖，抑制ECM降解。陳詩皓等[13]在培養原代小鼠固有淋巴樣2型細胞ILC2中加入10 μg/mL的粉塵螨粗提物，在24、36、48 h時收集細胞上清液進行檢測，結果發現其IL-6水平分別是空白組1、2、3倍；并且IL-6 mRNA的含量也逐漸升高，分別是空白組的5、10、15倍，呈現一定的時間依賴性。

2　細胞因子干預造模法

無論是病因明確的肺纖維化，還是其他病因不明的肺纖維化，其病理機制主要為成纖維細胞異常增殖轉型和ECM大量沉積。目前研究已經證實，肺纖維化的進程離不開細胞因子的介導，這些細胞因子包括TGF-β1、結締組織生長因子(CTGF)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和PDGF等，它們主要從促進纖維化形成、參與局部損傷和炎癥反應及抑制纖維化形成3個方面參與其中[14]。因此，可以借助這些細胞因子，對細胞進行干預，建立肺纖維化的體外模型。

2.1TGF-β TGF-β是目前公認的致纖維化作用最強的細胞因子，亞型中又以TGF-β1致纖維化能力最強[15]。Li等[16]用TGF-β1(5 ng/mL)刺激人胚成纖維細胞WI38 48 h后，發現β-catenin、FN和α-SMA蛋白表達均較空白組明顯增加；此時，細胞形態上也呈現出相應的纖維化特征。此外，TGF-β1還具有強烈的促進細胞增殖作用。駱亞莉等[17]發現，在同等劑量TGF-β1刺激下的人胚肺成纖維細胞HELF，其形態呈密集的團叢狀分布且數量增多、體積增大、胞質豐富。

2.2CTGF CTGF是TGF-β1致纖維化作用的直接下游介質，已被證實在肺、腎臟和肝臟的纖維化過程中發揮了作用，可導致膠原蛋白過度沉積，是重要的促纖維化因子，也是肺纖維化預后標記物[18]。黃曉燕等[19]用CTGF(20 ng/mL)刺激人胚肺成纖維細胞HFL-Ⅰ24 h，發現細胞向肌成纖維細胞轉化，α-SMA表達量為空白組的4倍。而Huang等[20]在此基礎上加入CTGF抑制劑后，發現此時的細胞增殖和遷移能力大幅度下降，ECM蛋白表達減少，但在TGF-β1的配合下，卻又促進了肺纖維化的發展進程。

2.3Ang Ⅱ AngⅡ是血管腎素-血管緊張素-醛固酮系統的組成部分，既是纖維增生的中介反應物，也是纖維化的重要調控因子[21]。Hao等[22]在用BLM誘導的嚴重肺纖維化和彌漫性肺部炎癥小鼠中發現，肺組織中Ang Ⅱ、IL-6、TGF-β1mRNA表達量分別升高了3、8、2倍，提示Ang Ⅱ是一種強有力的誘導因子，可通過TGF-β的自分泌，誘導肺泡上皮細胞的凋亡，激活成纖維細胞促進膠原蛋白產生和ECM合成。梁海海等[23]發現，AngⅡ(1 μmol/L)刺激MRC-5細胞可明顯增加細胞膠原生成；并通過α-SMA染色證實，細胞向肌成纖維細胞的轉化。

2.4PDGF 在纖維化早中期，PDGF可協調TGF-β1間接刺激成纖維細胞增殖、轉移和黏附，調節膠原、ECM沉積和降解，在肺纖維化性疾病發病機制中發揮越來越重要的作用[24]。Hostettler等[25]用PDGF(10 ng/mL)分別刺激特發性肺纖維化(IPF)患者原代肺成纖維細胞和正常肺組織細胞48 h后，發現兩種細胞增殖效應接近100%。王志勇等[26]以人肺癌細胞A549為研究對象，發現加入PDGF抗體(25 mg/L)后，可顯著加強細胞MMP-9的表達水平，并且可抑制細胞生長。

2.5胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ) IGF-Ⅰ是一類細胞增殖調控因子，在細胞的分化、增殖、生長發育和血管新生中具有重要的作用，同時也是引起肺泡炎癥和肺間質纖維化的重要因子[27]。Hung等[28]用IGF-Ⅰ(100 ng/mL)刺激小鼠肺成纖維細胞MLF，24 h后檢測發現Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達量均升高，分別是空白組的1.5、1.7倍；α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅲ的蛋白含量分別是空白組1.3、2、1.6倍。

3　總結與展望

隨著肺纖維化機制研究的不斷完善以及體外造模技術的發展，目前已經有多種造模方法。除了以上報道的常用的細胞模型方法外，還有用膽汁刺激酸肺泡上皮細胞、免疫抑制劑干預鼠胚胎成纖維細胞、石棉刺激肺泡巨噬細胞等[29,30]方法。研究者可根據具體的實驗條件、細胞來源以及研究需要靈活地選擇。

雖然肺纖維化的體外模型的方法多種多樣，但目前關于肺纖維化建立方法的金標準尚未統一。目前常用的細胞有胚胎肺成纖維細胞、肺泡上皮細胞、肺成纖維細胞等，干預方式有病因和細胞因子兩大類，常用的鑒定肺纖維化的方法為觀察細胞形態、測量膠原含量、以及檢測TGF-β1、Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA、E-cadherin、Vimentin等指標。然而，同一種細胞對不同干預方式的反應是不一樣的，究竟采用哪種細胞接受什么樣的干預刺激，并用何種指標來鑒定肺纖維化更具有代表性，可以作為肺纖維化體外模型的金標準，目前尚未明確。另外，還需特別指出的是，目前使用的肺纖維化體外模型建立方法大都使用單種干預方式對細胞進行刺激。然而，肺纖維化是個復雜的病理過程，需要借助多種細胞、多種炎癥因子進行參與。因此，在目前的工作基礎上，如何尋求多種體外模型聯合作用，才能建立更加貼近臨床的肺纖維化體外模型也是值得思考的問題。相信隨著現代科學技術的進步，理想而成熟的肺纖維化體外模型會逐漸建立起來，從而為肺纖維化疾病的診斷和治療提供更加有效的支持。