人源DNMT1基因啟動子熒光素酶報告基因載體的構建及其活性檢測

黃 滔，曹玉祥，張志堅，周興路，魏慧君，吳志浩

(1.皖南醫學院 臨床醫學院，安徽 蕪湖 241002；2.安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241000；3.天津醫科大學總醫院 肺癌研究所，天津 300052；4.皖南醫學院 檢驗學院，安徽 蕪湖 241002；5.皖南醫學院 活性生物大分子研究重點實驗室，安徽 蕪湖 241002；6.皖南醫學院 基礎醫學院，安徽 蕪湖 241002)

DNA甲基化是哺乳動物基因組中最常見的表觀遺傳修飾，主要由DNA甲基轉移酶的催化來實現[1]。DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)是人體內存在的最重要的甲基轉移酶，起著維持甲基化的作用[2]。DNMT1是DNMTs的一個重要亞型，編碼1495個氨基酸，其羥基端是保守的催化甲基化反應結合域。DNMT1在多種腫瘤細胞中高表達，如白血病[3]、非小細胞肺癌[4]、子宮內膜癌[5]等，與腫瘤的發生、發展、耐藥和預后有著緊密聯系，可被選作腫瘤去甲基化治療的靶點[6]。目前關于調控DNMT1的分子機制和生物學意義的研究較少，因此克隆DNMT1基因啟動子熒光素酶報告基因載體為深入研究其調控機制和生物學意義奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養基 (HyClone 公司);pGL3-Basic 質粒、質粒小量提取試劑盒 (Promega公司);Polyjet (恩博生物公司);限制性核酸內切酶XhoⅠ和KpnⅠ (NEW ENGLAND BioLabs公司);T4 DNA連接酶 (TaKaRa 公司);細胞基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)；E.coli DH5α Competent Cells (TaKaRa公司);PCR產物純化試劑盒(天根公司產品)，A549細胞和H1299細胞為實驗室凍存。

1.2 方法

1.2.1 細胞基因組DNA的提取 由實驗室凍存的A549細胞復蘇后，利用細胞基因組DNA提取試劑盒提取A549基因組DNA，利用分光光度計檢測器檢測提取DNA的濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整度。

1.2.2 DNMT1基因啟動子克隆 在UCSC Genome Browser網站上查找出DNMT1基因啟動子序列，根據序列利用Oligo 7設計出上游和下游引物，加上KpnⅠ和XhoⅠ 酶切位點和保護堿基。……