HPLC法同時測定4種焙炒咖啡豆中6種有機酸方法初探

武瑞瑞，李貴平，黃 健，李亞男，楊 陽，黃家雄

(云南省農業科學院 熱帶亞熱帶經濟作物研究所，云南 保山 678000)

咖啡是用經過烘焙的咖啡豆制作出來的飲料，與可可、茶同為流行于世界的主要飲品，在味覺上會呈現出不同程度的甜度、酸度、醇厚度、干凈度。喝咖啡時所感受到的酸味主要來自烘焙過程中生產的酸。烘焙豆中的酸主要是咖啡的水溶性綠原酸、奎寧酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、醋酸、甲酸、乳酸、甘醇酸等三十多種有機酸以及無機磷酸。脂肪族酸(包括醋酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、甲酸)濃度高易有尖酸味。脂肪族酸帶有大量的氫離子是咖啡酸滋味的主要來源。而酚酸(包括綠原酸與奎寧酸)濃度高，已有苦味[1]。

因綠原酸是咖啡的功能性物質，且綠原酸含量多時會引起咖啡的澀味。近幾年來，對咖啡成分含量測定主要集中在功能成分方面，如綠原酸[2-7]、咖啡因[2-4，6-11]、葫蘆巴堿[3-4]、奎寧酸[12]等，不僅研究咖啡飲品中功能成分的含量[2-3,9]，也研究咖啡生豆[5-6]、咖啡焙炒豆[7-8,11]、速溶粉[4,12]等中功能成分含量。而對引起咖啡酸味的脂肪族酸含量的報道很少。而檸檬酸、蘋果酸等引起的這種酸味，可以使人愉快，是比較好的咖啡味道[13]。本研究采用高效液相色譜法，通過優化色譜條件，同時測定焙炒咖啡豆中酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、富馬酸等6種有機酸含量，為健全咖啡豆質量評價標準、完善咖啡品鑒體系提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

戴安高效液相色譜儀(美國Thermo-U3000)，循環水真空泵(鞏義予華SXZ-B3)，超純水儀(力康Heal Force Easy15)，離心機(上海安亭TGL-16aR)。

1.2 試劑

焙炒咖啡：景蘭咖啡(云南景蘭熱作科技有限責任公司生產)、埃塞俄比亞咖啡(Tomoca. Coffee Pvt. Ltd. Co.)、干法加工和濕法加工保山熱經所辦公樓前的咖啡；檸檬酸標準品、蘋果酸標準品、富馬酸標準品、酒石酸標準品、甲醇(色譜純)、磷酸，由西格瑪奧德里奇公司生產。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 nm,5 μm),流動相：甲醇∶0.1%磷酸=25∶75，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm。

2.2 標準溶液和樣品液的配制

2.2.1 混合標準溶液的配制 分別用移液槍吸取50 mg/mL蘋果酸100 μL、25 mg/mL酒石酸100 μL、50 mg/mL檸檬酸80 μL、50 mg/mL富馬酸(即反丁烯二酸)1 μL、50 mg/mL沒食子酸(3,4,5-三羥基苯甲酸)1 μL、62.5 mg/mL琥珀酸(即丁二酸)160 μL，置于高效液相樣品瓶中，用甲醇(色譜純)稀釋至1 mL，搖勻即可。所得溶液中蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、富馬酸、沒食子酸、琥珀酸的濃度分別為5、2.5、4、0.05、0.05、1 mg/mL。

2.2.2 樣品液的配制 咖啡豆用咖啡磨3檔磨碎，取咖啡粉5 g，置于50 mL的容量瓶中，用純水定容，于40 ℃水溫中超聲5 min取出，搖勻，倒入1.5 mL的離心管，離心15 min。離心條件：轉速10000 r/min，溫度4 ℃。離心后過膜，取濾液作為樣品溶液。平行3份。

2.3 樣品提取方法的考察

2.3.1 咖啡粉的粗細 咖啡豆用1、3、4、5、6、7、8號檔位研磨，8號咖啡粉最粗，1號咖啡粉最細。準確稱量5 g咖啡粉共7份，分別用純水溶解，定溶于50 mL的容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，重復測定3次峰面積，取平均值。測定結果見表1。在磨豆機3號檔位時，咖啡粉在40 ℃水溫中超聲5 min時，各成分的含量最高，所以選擇3號檔位磨碎咖啡豆。

2.3.2 不同咖啡粉重量 咖啡豆用3號檔位研磨，分別準確稱量1、2、5 g咖啡粉各3份。用沸騰的純水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，重復測定3次峰面積，取平均值。結果見表2。咖啡粉量為5 g時，各成分的含量最高，所以選擇咖啡粉量為5 g。

表1 咖啡粉粗細的確定

2.3.3 提取溫度 咖啡豆用3號檔位研磨，準確稱量5 g咖啡粉6份，分成2組。一組用沸騰的純水溶解，一組用常溫的純水溶解，均定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，重復測定3次峰面積，取平均值，結果見表3。常溫水中各成分含量最高，所以選擇水溫為常溫。

2.3.4 提取時間 咖啡豆用3號檔位研磨，分別準確稱取5 g咖啡粉共7份。用純水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲，分別超聲提取5、10、20、30、40、50、60 min，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，測定峰面積，結果見表4。在咖啡豆用3號檔位研磨時，超聲5 min時，各成分的含量最高。因此，選超聲時間為5 min。

表2 咖啡粉重量的確定

表3 純水溫度的確定

表4 咖啡粉提取時間的確定

2.4 含量測定

樣品中有機酸的含量以1 kg所含的克數表示，具體計算公式如下：

其中：C由標準曲線求得某有機酸的體積，再計算某有機酸的濃度，單位為mg/mL；V為樣品溶液定容體積，單位為mL，為50 mL；m為樣品量，單位為g；1000為換算系數。

2.5 標準曲線的繪制

自動進樣標準品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以標準品體積為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線[14]。

表5 6個標準品的標準曲線

2.6 精密度試驗

咖啡豆用3號檔位研磨，分別準確稱取5 g咖啡粉。用純水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，重復進樣3次，測定峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，精密度試驗結果見表6。

表6 咖啡豆精密度試驗結果

2.7 重復性試驗

咖啡豆用3號檔位研磨，分別準確稱量3份5 g咖啡粉。用純水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，測定峰面積，每份重復3次，計算相對標準偏差(RSD)，重復性試驗結果表7。

2.8 穩定性試驗

咖啡豆用3號檔位研磨，準確稱量3份5 g咖啡粉。用純水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，分別在0、1、2、3 h進樣1 μL，測定1次，計算該組含量的平均值及其相對標準偏差(RSD)。

表7 咖啡豆重復性試驗結果

表8 咖啡豆穩定性試驗結果

2.9 回收率試驗

咖啡豆用3號檔位研磨，取5 g咖啡粉，用純水溶解，定溶于50 mL容量瓶中。于水溫40 ℃中超聲5 min，按配制樣品液的方法制備，再加入標準品溶液100 μL(酒石酸含量為0.5 mg、蘋果酸含量為0.25 mg、檸檬酸含量為0.4 mg、琥珀酸含量為0.005 mg、沒食子酸含量為0.005 mg、富馬酸含量為0.1 mg)的樣品瓶中,再加入樣品液400 μL，分別進樣4、6、8 μL，平行測定3次，試驗結果見表9。

表9 6種有機酸的回收率

2.10 樣品有機酸成分測定

取云南景蘭熱作科技有限責任公司的焙炒咖啡、埃塞俄比亞焙炒咖啡、濕法加工和干法加工的焙炒咖啡樣品，按配制樣品液的方法制備，進樣1 μL，平行測定3次，試驗結果見表10。

表10 樣品有機酸成分檢測結果 g/kg

3 討論

(1)本文以酒石酸、蘋果酸等6種有機酸為指標對提取工藝進行了優化。結果顯示，常溫水提取效率高于熱水提取效率。故本試驗采用常溫水提取咖啡粉的方法。在此基礎上，以料液比、提取時間、粉的粗細度為考察因素，優化提取工藝，最終選擇咖啡豆提取工藝為1∶10的料粉比、水溫40 ℃超聲提取5 min、磨豆機3號檔位的粉粗細度。

(2)液相色譜中酒石酸、蘋果酸等6種有機酸均能達到基線分離，能較好地對酒石酸、蘋果酸等6種有機酸進行定量檢測，系統適用性較好。為了獲得滿意的分離效果，流動相比例進行了不同的嘗試。在流動相甲醇∶0.1%磷酸=25∶75時，液相圖譜各峰分離效果最好，故選擇流動相為甲醇∶0.1%磷酸=25∶75。

4 結論

有機酸不僅是風味物質，也是重要的中藥成分，在人體內可促進消化和維持酸堿平衡[15]。所以咖啡質量評價標準時應增加有機酸含量的測定，更加全面地了解咖啡。而該法簡單、快速、靈敏度，6種有機酸得到很好的分離,適用于咖啡有機酸的分離和鑒定。

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