Neurogenin 3在胰島β細胞再生中的研究進展

李澤平，翟佳佳，焦慧鳳,3，陳彥霖，李曉苗△

1.南昌大學瑪麗女王學院(南昌 330031)，2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院內(nèi)分泌科(西安 710032)，3.南昌大學基礎(chǔ)醫(yī)學院(南昌 330031)

主題詞 @Neurogenin 3 胰島素分泌細胞 再生

胰腺具有內(nèi)分泌功能，通過胰島細胞分泌多種激素，對穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和生長發(fā)育均有重要作用。人類的胰島中具有五種內(nèi)分泌細胞：分泌胰高血糖素的α細胞，分泌胰島素的β細胞，分泌生長抑素的δ細胞，分泌Ghrelin的ε細胞，分泌胰多肽的PP細胞。糖尿病和β細胞的功能障礙和缺失有直接聯(lián)系。1型糖尿病表現(xiàn)為胰島素的絕對缺失，其原因是患者自身免疫導(dǎo)致的β細胞破壞。對于1型糖尿病的治療，胰島細胞移植的方法存在很大障礙，所以再生醫(yī)學成為廣泛關(guān)注熱點。同樣，對于2型糖尿病，通過誘導(dǎo)獲得功能性的β細胞也將是未來的治療目標。研究指出，多種轉(zhuǎn)錄因子在胰島發(fā)育和細胞生成上有重要作用[1]。在發(fā)育階段，bHLH(basic helix-loop-helix)家族蛋白中Ngn 3有促使胰腺祖細胞向內(nèi)分泌細胞分化的作用;在生理條件下,成熟胰島細胞表達的Ngn 3可以促使胰島細胞成熟并能維持其功能[2]。本文就Ngn 3對胰島β細胞分化發(fā)育和轉(zhuǎn)化再生中的研究進展進行綜述。

1 Neurogenin 3及其生理特性

Ngn 3是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子，對于胰島內(nèi)分泌細胞的特異性很重要。研究表明，敲除了Ngn 3基因的小鼠不能產(chǎn)生內(nèi)分泌細胞[3]，同時這些小鼠也不表達Ngn 3調(diào)節(jié)胰島細胞分化的下游基因，如 Neuro D1，Pax 4和 Pax 6等[4]。Ngn 3的表達被認為是胰腺內(nèi)分泌祖細胞的重要特征。研究證明，Ngn 3的多位點磷酸化控制其促進腺胰內(nèi)分泌分化的能力，在促增殖的同時具有維持β細胞功能，并且可被用來在體外和體內(nèi)促進和維持內(nèi)分泌分化進行[5]。

胰腺的發(fā)育過程里內(nèi)分泌發(fā)育方面,Pdx 1(Pancreas/duodenum homeobox protein-1)基因編碼的Pdx 1蛋白以特異性地結(jié)合 Ngn 3基因上游啟動子的方式，調(diào)控Ngn 3基因在Ngn 3+細胞的表達[6]。大量轉(zhuǎn)錄因子基因由Ngn 3蛋白調(diào)控, 經(jīng)過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，胰腺內(nèi)分泌發(fā)育由這些轉(zhuǎn)錄因子編碼基因及其產(chǎn)物蛋白進行調(diào)控。Notch信號通路對胰腺祖細胞朝向內(nèi)分泌細胞與導(dǎo)管細胞的分化具有重要的生理學意義。在發(fā)育過程中，Notch的作用是抑制胰腺祖細胞的分化，啟動胰腺內(nèi)分泌和導(dǎo)管上皮細胞的分化[7]。在抑制胰腺內(nèi)分泌分化的進程中，Notch的高表達可以誘導(dǎo)Hes 1基因，而Hes1是Ngn 3的阻遏蛋白，可以抑制Ngn 3表達。

2 促進細胞發(fā)生的作用

Ngn 3在發(fā)育時期可促胰島祖細胞分化。大約在胚胎9.5d的小鼠，部分增厚DE上皮細胞開始表達Ngn 3。基因譜系跟蹤顯示，Ngn 3(+)細胞形成所有的胰腺內(nèi)分泌細胞。Ngn 3(+)細胞從部分導(dǎo)管結(jié)扎的小鼠胰腺純化后，注入一個Ngn 3基因敲除胎胰后，Ngn 3(+)細胞可分化為所有的胰島細胞[8]。 胰腺祖細胞中高水平的Ngn 3表達對于啟動內(nèi)分泌分化是必需的和足夠的。 Notch-Hes1介導(dǎo)的信號明確控制正在發(fā)育的胰腺中Ngn 3表達細胞的數(shù)量，同時 Myt1b和Ngn 3形成一個調(diào)節(jié)內(nèi)分泌分化的前饋表達環(huán)以控制個體胰腺細胞中Ngn 3表達的水平[8]。Ngn 3基因敲除的胰腺內(nèi)分泌發(fā)育受到消極影響,胰島亦無法形成,同時葡萄糖感應(yīng)系統(tǒng)缺失,小鼠產(chǎn)后死于糖尿病[10]。一種罕見的新亞型新生兒永久性糖尿病的原因及歸咎于Ngn 3不足。另有遺傳分析表明,位于Ngn 3基因螺旋(helix) II區(qū)的E123X缺失,可導(dǎo)致新生兒早產(chǎn)及新生兒的糖尿病(新生兒胰腺存在但功能缺陷)。此外，Ngn 3的異位表達,可上調(diào)下游基因NeuroD1表達水平,導(dǎo)致小鼠早產(chǎn)和胰島細胞異位分化,其胰島細胞主要生成胰高血糖素[6]。

研究顯示Ngn 3轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達發(fā)生在兩個時間波中，第一個發(fā)生在大約E8.5到E11.0的早期，第二個發(fā)生在大約E12.0[11]。引人注目的是，這種觀察到的雙相表達與“第一”和“第二”轉(zhuǎn)變相關(guān)，其包含胚胎內(nèi)分泌分化的兩種不同波。Ngn 3轉(zhuǎn)錄物在胰腺上皮細胞中顯著比Ngn 3蛋白更廣泛，表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)可能在內(nèi)分泌分化過程中起關(guān)鍵作用。

3 β細胞再生中Neurogenin 3的研究

3.1 骨髓間充質(zhì)干細胞 成熟動物個體內(nèi)的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有跨胚層橫向分化的能力。骨髓中主要有兩個細胞系統(tǒng):血細胞系統(tǒng)和基質(zhì)系統(tǒng),基質(zhì)系統(tǒng)為血細胞系統(tǒng)提供結(jié)構(gòu)和功能支持。骨髓間充質(zhì)干細胞bmMSCs是基質(zhì)系統(tǒng)中一種具有多向分化潛能的非造血干細胞[12-13]。

研究結(jié)果[12]提示：Ngn 3誘導(dǎo)過的大鼠的bmMSCs基因?qū)用嫔峡梢燥@著表達胰島素基因；并且在細胞層面上，細胞聚集生長,可以觀測到類似胰島的細胞團產(chǎn)生。這類細胞團能夠產(chǎn)生一些僅僅胰島β細胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物，乃至胰島素的表達也可測得。但實驗表明,誘導(dǎo)bmMSCs產(chǎn)生的細胞僅僅表達少量的胰島素,較之原代胰島細胞的表達量，其表達量較少。可以得出結(jié)論，Ngn 3蛋白誘導(dǎo)后的bmMSCs并非完全分化。其分化產(chǎn)物為胰島素表達細胞,而非胰島β細胞。因此，探索如何高效誘導(dǎo)bmMSCs分化,使其成為胰島β細胞是未來的研究方向。

內(nèi)分泌譜系的兩種主要調(diào)節(jié)基因Ngn 3和Pdx1的異位表達引發(fā)了胰腺內(nèi)分泌基因表達，特別是胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2和生長抑素。 研究指出[13]，Ngn 3和(或)Pdx1蛋白的轉(zhuǎn)基因過表達不僅直接誘導(dǎo)目標基因，如NeuroD1和胰島素，而且還引發(fā)基因表達的部分涉及胰腺內(nèi)分泌分化的級聯(lián)。值得注意的是，異位Ngn 3單獨足以啟動表達特定的β細胞譜系相關(guān)基因。這種重新編程的bmMSC細胞誘導(dǎo)葡萄糖不敏感的胰島素生物合成和分泌。其意義表明部分重新編程的人bmMSC中葡萄糖依賴性胰島素分泌的建立可能取決于額外的成熟因子，如Ngn 3。

3.2 臍帶間充質(zhì)干細胞 2015年的研究指出[14]，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUMSCs) 的誘導(dǎo)過程中，Ngn 3可以被觀察到水平的逐漸升高,14d時可達到峰值，直到21d下降。

研究指出[15],Notch信號通路被抑制后，Ngn 3表達水平顯著上升。誘導(dǎo)hUMSCs的過程中測量Ngn 3與Hes1的表達變化也大體印證了如此[14]。因此此時或許存在Hes1表達對Ngn 3的抑制作用。可以得出，Ngn 3同Hes 1之間存在有固有聯(lián)系，進一步證明了Notch信號經(jīng)下游的靶基因產(chǎn)生的Hes等物質(zhì)抑制間充質(zhì)祖細胞分化的潛在機制[14]。

3.3 脂肪間充質(zhì)干細胞 研究表明[16]，導(dǎo)入Ngn 3的上游基因Pdx 1基因于脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose tissue-derived stem cells ,ADSC)后15d，胰島分泌的關(guān)聯(lián)基因Ngn 3和Islet-1的表達可以被檢測到。Pdx 1能誘導(dǎo)ADSC向胰島分泌細胞方向進行分化，而且在周圍環(huán)境中的葡萄糖的濃度升高時，胰島素可以被檢測到；Pdx 1對細胞產(chǎn)生Ngn 3具有促進作用。未來，ADSC是潛在的治療糖尿病的手段。

ADSC屬于成體干細胞，其可以多向分化，且不存在倫理學問題。另一方面在臨床上容易獲得。已有技術(shù)通過在體外轉(zhuǎn)染Pdx1和Ngn 3慢病毒并聯(lián)合NECA及多種細胞因子的方法將ADSC誘導(dǎo)為胰島β樣細胞[17]。但令人遺憾的是，該手段所誘導(dǎo)出的胰島β樣細胞并非完全成熟。

3.4 人類誘導(dǎo)的多能干細胞 研究團隊設(shè)計了一個合成的譜系控制網(wǎng)絡(luò)[18]，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)合了香草酸引發(fā)的相互排斥的轉(zhuǎn)錄因子Ngn 3和Pdx1伴隨MafA(V-maf肌肉骨骼肌纖維肉瘤癌基因同源物A)的誘導(dǎo)。這種由不同網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)組成的網(wǎng)絡(luò)，可以及時控制轉(zhuǎn)基因和基因組Ngn 3，Pdx1和MafA變異體，能夠?qū)⑷祟愓T導(dǎo)的多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hIPSCs)衍生的胰腺祖細胞編程為葡萄糖敏感的胰島素分泌型β樣細胞，其葡萄糖刺激的胰島素釋放動力學與人類胰島相當。合成的譜系控制網(wǎng)絡(luò)可能提供缺失的環(huán)節(jié)，將體細胞遺傳編程為再生醫(yī)學的自體細胞表型。

將來自人皮膚成纖維細胞的hIPSCs體外培養(yǎng)并定向誘導(dǎo)分化20d[19]的測量表明：胰島素相關(guān)基因MafA，胰島素，Glut2，Nkx 6.1，GCK和Tcf 1在分化過程中表達增加，并且在第20天幾乎達到峰值。類似地，轉(zhuǎn)錄因子Pdx 1，Ngn 3和Pax 6的表達在分化過程中表現(xiàn)出增強的表達。ChIP實驗證實，通過與胰島素(胰島素-P)，Ngn 3(Ngn 3-P)和Pax 6(Pax6-P)的啟動子區(qū)域組合，Pdx 1激活下游轉(zhuǎn)錄因子Ngn 3和Pax6的表達。Pdx1激活下游轉(zhuǎn)錄因子Ngn 3和Pax 6，并且可能是促進hIPSCs向胰島β細胞分化的機制之一。

3.5 人類胚胎干細胞 胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESC)是具有自我更新和多向分化潛能的細胞，它的起源是囊胚的內(nèi)細胞團,經(jīng)誘導(dǎo)可體外定向分化為胰腺系細胞。上述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還可以編程Ngn 3，Pdx1和MafA在人胚胎干細胞衍生的胰祖細胞中的表達動力學并且驅(qū)動這些細胞分化成葡萄糖敏感的胰島素分泌型β樣細胞[20]。因此，合成譜系控制網(wǎng)絡(luò)似乎是用于基因研究和再生醫(yī)學將多能干細胞分化為體細胞類型的可靠方法。

另外，先前的研究中[21]，實驗測定了delta-notch 1ike EGF相關(guān)受體在Ngn 3(+)胰島祖細胞差異表達，這表明抑制Notch信號通路對內(nèi)分泌細胞的分化是至關(guān)重要的，并且可促進Ngn 3(+)胰島祖細胞的分化形成。

3.6 胰外分泌細胞 通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)育性轉(zhuǎn)錄因子Ngn 3，可以重編程從成人胰腺分離的導(dǎo)管細胞以表達胰島β細胞基因[22]。Ngn 3刺激導(dǎo)管細胞表達聚焦的一組基因，這些基因是胰島內(nèi)分泌細胞和/或神經(jīng)組織的特征[23]。然而，這種神經(jīng)內(nèi)分泌移位是不完全的，只有不到10%的完全導(dǎo)管-內(nèi)分泌重編程達到。外源Ngn 3的轉(zhuǎn)導(dǎo)激活內(nèi)源性Ngn 3，表明該基因的自我激活。此外，通過抑制Delta-Notch信號傳導(dǎo)以及通過共表達轉(zhuǎn)錄因子Myt1而非MafA和Pdx 1，可以適度增強胰腺內(nèi)分泌重編程[22]。

研究已經(jīng)使用胰腺外分泌細胞的標準體外模型(大鼠AR42j-B13細胞系)研究了胰外分泌細胞轉(zhuǎn)化過程的機制[23-24]。一種新的編碼所有三種基因的腺病毒載體稱為Ad-PNM(腺病毒Pdx1，Ngn 3，MafA構(gòu)建體)。當引入AR42j-B13細胞時，Ad-PNM引起扁平形態(tài)的快速變化和細胞分裂的停止。外分泌標記的表達受到抑制。兩種胰島素基因都被上調(diào)，以及許多通常以β細胞為特征的轉(zhuǎn)錄因子。在染色質(zhì)水平上，Pdx 1，Ins1和Ins 2基因啟動子的組蛋白尾修飾向與基因活性相關(guān)的方向移動，并且在Ins 1啟動子處DNA CpG甲基化水平降低。但是這種轉(zhuǎn)型并不完整。細胞缺乏對β細胞功能重要的幾種基因的表達，并且它們不顯示對葡萄糖敏感的胰島素分泌。結(jié)論是，對于這種外分泌細胞模型，盡管轉(zhuǎn)化是顯著的，但重編程并不完整，并且缺乏β細胞表型的關(guān)鍵方面。

3.7 肝臟細胞 研究表明[25]，Ngn 3的肝基因轉(zhuǎn)移在終末分化的肝細胞中瞬時誘導(dǎo)胰島素，但未能轉(zhuǎn)分化它們，即將它們的譜系轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u細胞。然而，由于出現(xiàn)門靜脈胰島樣細胞簇，Ngn 3導(dǎo)致小鼠的長期糖尿病逆轉(zhuǎn)。這些新胰島似乎來自肝祖細胞，最可能是內(nèi)胚層衍生的卵圓細胞。

3.8 人類膽樹干細胞 實驗通過質(zhì)譜有效產(chǎn)生了與人Pdx1的一級結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的純化的Pdx 1蛋白，并轉(zhuǎn)導(dǎo)入人類膽樹干細胞(human biliary tree stem cells，hBTSCs)中。Pdx 1暴露僅在hBTSCs中觸發(fā)中間和成熟階段β細胞分化標志物的表達，暴露于Pdx 1的hBTSC顯示胰島素[26]。關(guān)于Ngn 3在hBTSCs的表達和誘導(dǎo)作用有待探討。

4 展 望

Ngn 3是基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，并且它在胰腺發(fā)育期間形成內(nèi)分泌祖細胞是必不可少的。Pdx 1是屬于ParaHox家族的一種主要的胰腺轉(zhuǎn)錄因子，它對于在胚胎中形成胰芽以及隨后形成β細胞的形成和功能都是必需的。MafA是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，它是β細胞成熟所必需的[23]。這三者之間具有普遍的聯(lián)系。

整個胰腺移植和分離的胰島移植的報道表明，替代產(chǎn)生胰島素的組織可以潛在地治愈胰島素依賴性糖尿病。然而，由于缺乏合適的器官供體和需要永久性免疫抑制，使用這種治療方法受到限制。因此，仍然需要安全和充足的產(chǎn)生胰島素的細胞來源。最有前途的方法之一是將胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞分化為產(chǎn)生胰島素的細胞，這主要是由于其高效率和高質(zhì)量地產(chǎn)生衍生細胞。然而，該方法的臨床應(yīng)用可能受到轉(zhuǎn)化為惡性細胞的潛在風險的限制。如果細胞重編程為β細胞最終成為臨床使用的方法，為了避免直接將基因?qū)胍认倏赡軙?dǎo)致致癌轉(zhuǎn)化的風險[27],可能采取體外細胞轉(zhuǎn)化的形式。無論是通過直接重編程還是從其他來源獲得β細胞，如多能干細胞的定向分化[28]，都有必要證明轉(zhuǎn)化后的細胞確實可以治愈糖尿病,且需要在進行前仔細鑒定細胞表型。

很多細胞都可以用來轉(zhuǎn)化生成胰島素表達的細胞，本文僅列舉了具有代表性的與Ngn 3相關(guān)的細胞類別，關(guān)于Ngn 3的表達還有很多研究的前景。近年研究指出，2型糖尿病中β細胞去分化是一個可逆過程[29]，在誘導(dǎo)其再分化過程中Ngn 3的作用也是未來的研究之一。