人乳頭瘤病毒分型檢測方法學性能評價

王益松，仲崇明

(南京中醫藥大學連云港附屬醫院，江蘇 連云港222004)

宮頸細胞學檢查已普遍應用于宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的篩查，可發現早期病變[1，2]。傳統巴氏涂片宮頸細胞學檢查存在其固有的局限性[3，4]。高危型HPV核酸檢測用于宮頸細胞學檢查異常患者的分流及宮頸癌篩查，可有效地增加宮頸癌病變檢出率，提高細胞學檢查的敏感性和準確性，并降低篩查頻率或避免過度醫療。目前，HPV核酸檢測技術很多[5，6]，但無統一標準。確立良好的性能指標并充分理解HPV檢測臨床意義，對試劑產品方法學分析性能及臨床性能評價至關重要。本文參照《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》（國家食品藥品監督管理局，2015年11月26日發布），針對本實驗室開展HPV-21分型檢測所使用試劑產品作方法學分析性能評價。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HPV-21分型檢測試劑：潮州凱普生物化學有限公司產品；PCR擴增儀：型號為TL-988，為西安天隆科技有限公司產品；導流雜交儀：型號為HHM-2，為廣東凱普生物科技股份有限公司產品。HC2二代雜交捕獲方法儀器型號為DML2000，為凱杰企業管理（上海）有限公司，試劑為凱杰配套產品。

陽性參考品：批號20170101；A組質粒型別為HPV 6、44、18、33、52、66、CP8304；B 組質粒型別為HPV 11、43、31、45、56、58、68；C 組 質 粒 型 別 為HPV 16、35、39、51、53、59；D 組質 粒 型別為 HPV 42；E 組質粒型別為 HPV 26、54、72、84；HPV 陰性參考細胞系。陽性、陰性參考品均為潮州凱普生物化學有限公司產品。

1.2 評價指標 準確性、交叉反應、特異性、檢測限、重復性、干擾。

1.3 方法 準確性：對A、B、C、D組質粒參考品，加樣1μl，按程序擴增，按程序雜交，觀察陽性符合率；交叉反應：E組質粒加樣1μl，按程序擴增，按程序雜交，觀察陰性符合率；特異性：HPV陰性參考細胞系按正常程序提取DNA，正常程序擴增、雜交，觀察陰性符合率；檢測限：A、B、C、D組質粒參考品作2倍、5倍稀釋，每管重復5次，各加樣1μl，按程序擴增、雜交，觀察陽性符合率；重復性：隨機選取HPV陽性受檢者樣本5例，重復2次檢測，觀察陽性符合率；干擾：設定紅細胞、白細胞、異丙醇為干擾因素。在提取后擴增樣本中分別加入不同量值異丙醇，正常程序擴增、雜交，觀察陽性符合率，以判斷異丙醇干擾性；取紅細胞、白細胞含量較多，以HC2（二代雜交捕獲）方法檢測結果為HPV16、HPV18陽性樣本各10例，并以HPV-21分型檢測試劑（潮州凱普生物化學有限公司產品）檢測，觀察陽性符合率，以判斷紅細胞、白細胞干擾性。

2 結果

2.1 準確性 A、B、C、D組質粒共包含高危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68， 低危型 HPV 6、11、42、43、44、CP8304， 共 21 HPV分型。檢測結果均顯陽性，“IC”點顯色正常（擴增質控點），“Biotin”點顯示正常（顯色質控點），陽性符合率100%。

2.2 交叉反應 E組質粒型別為 HPV 26、54、72、84，本實驗室開展HPV-21分型試劑外HPV型別。實驗結果均為陰性，無交叉反應。

2.3 特異性 HPV陰性參考細胞系實驗結果為HPV21型別均顯陰性，符合產品要求。

2.4 檢測限 A、B、C、D組質粒參考品濃度均為350拷貝/μl，當2倍或5倍稀釋后，5管重復檢測結果均有陰性；350拷貝/μl濃度，各型別5管重復均顯示陽性。實驗結果顯示試劑產品檢測限為350拷貝/μl。

2.5 重復性 隨機選取HPV陽性受檢者樣本5例，重復2次檢測，2次重復檢測結果一致。

2.6 干擾 紅細胞、白細胞含量較多樣本，以HC2（二代雜交捕獲）方法檢測結果與HPV-21分型檢測試劑（潮州凱普生物化學有限公司產品）檢測，陽性符合率 100%；10μl異丙醇加入后，“IC點”（擴增質控點）和HPV陽性樣本無陽性反應。

3 討論

研究[7，8]顯示在已知100多種HPV型別中，有30多種型別在宮頸癌中被檢測到。HPV分型檢測要求：不同基因型別，要有特異的引物和探針；在HPV核酸檢測試劑盒設計時，要求考慮到HPV檢測限與特異度之間的平衡，避免產生交叉反應；國內試劑盒設計時，不僅要參考國外文獻報道的HPV基因型別，還要考慮到國內流行的HPV型別；對試劑盒質量監測需有內標設計及對實驗操作有質量控制要求[9]。目前，國內HPV核酸檢測（分型檢測）已廣泛開展，但方法學（試劑）多樣[10，11]。 目前 HPV 檢測試劑國產與進口均有使用。國外進口主要以PCR熒光探針和酶切信號放大方法為主，約有5家生產企業。國產HPV檢測試劑生產廠家近15家，40多種產品[12]。方法學準確性和可靠性不一，尚無統一標準化。在尚沒有標準化的情況下，各種方法學性能評價對保證檢測結果準確性、可靠性尤顯重要。

本文參照《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》（國家食品藥品監督管理局，2015年11月26日發布），針對本實驗室開展HPV-21分型檢測所使用試劑產品作方法學分析性能評價。結果顯示：1準確性：21型別陽性檢出率100%，“IC”點顯色正常 （擴增質控點），“Biotin”點顯示正常（顯色質控點）；2 交叉反應 試劑檢測21分型之外4個分型 （HPV 26、54、72、84）實驗結果均為陰性，無交叉反應；3檢測限實驗結果顯示試劑產品檢測限為350拷貝/μl；4重復性 隨機選取HPV陽性受檢者樣本5例，重復2次檢測，2次重復檢測結果一致；5干擾 紅細胞濃度大于0.758×1012/L時，加入白細胞濃度大于18.3×109/L時，異丙醇多于 10μl時，對 HPV 陽性樣本有干擾。結果提示本實驗室使用HPV-21分型檢測試劑產品性能（準確性、交叉反應在、檢測限、重復性）符合該產品性能指標要求，符合《人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則》分析性能評估指標要求；高濃度紅細胞、高濃度白細胞，異丙醇殘留量較多可干擾HPV陽性檢測。持續高危型HPV感染是誘發子宮頸癌重要原因，目前HPV檢測已廣泛應用于臨床[13-16]，注重HPV檢測方法學性能評價，是臨床應用的保證，對臨床應用有著重要的作用和價值。

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