p53基因在食管癌治療中的表達及作用

張加勇　胡欣　文世民

(川北醫學院第二臨床醫院·南充市中心醫院腫瘤中心，四川 南充　637000)

食管癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，腫瘤發病率位于全球第8位，死亡率位于第6位。我國食管癌發病率和死亡率均居世界首位，每年約21萬人死于食管癌，占全球食管癌死亡患者一半以上[1]。食管癌高死亡率的主要原因是缺乏有效的診斷及治療方法。食管癌發病機制復雜，研究發現其具有多階段、多因素、進行性演進的特點，基本過程包括正常粘膜→基底細胞過度增生→不典型增生→原位癌→浸潤癌[2]。在這過程中，有多種調整因子共同參與細胞的癌變。癌基因的激活和抑癌基因的失活是細胞癌變的分子基礎。近年來，隨著對分子生物學研究的發展，對于疾病的病因、發生、發展的研究已深入到了分子水平。基因治療已逐漸從理論成為現實，具有：選擇性強、副作用小、對晚期腫瘤及轉移灶的治療仍有效等優點，各類研究實驗表明p53基因對食管癌的治療有重要臨床意義[3,4]。目前手術、放療、化療都是食管癌治療的重要手段，而對于不能手術或不愿手術治療的患者放化療是該病治療的主要手段，但中晚期食管癌的治療效果仍不甚滿意，因此利用p53基因治療食管癌在臨床應運而生，且已取得一定效果。本文將近年來p53基因與食管癌治療的研究進展做一簡要綜述。

1　p53基因的結構及表達

p53基因位于染色體17q13.1，含11個外顯子，其轉錄翻譯編碼的野生型P53(WtP53)蛋白由393個氨基酸殘基組成，有多個功能域。主要由定位于氨基酸1-50位間的N-末端的轉錄激活結構域AD1、AD2與通用轉錄因子TFIID結合而發揮轉錄激活功能，p53與TFIID中的TAF結合，作用于下游基因啟動子中的TATA box，起到轉錄激活功能；定位于氨基酸65-90位間的生長抑制結構域，富含脯氨酸，有5重復的PXXP序列，可與含SH3結構域的蛋白質相互作用，將p53與信息傳遞途徑連接起來。另外還有：定位于氨基酸100-300位間序列特異的DNA結合結構域；定位于氨基酸殘基316-325位間的核定位信號NLS；定位于氨基酸殘基334-356位間的四聚體寡聚化結構域；C-末端非專一DNA調節結構域，可提供DNA損傷信號并參與核心區與DNA 結合的別構調節。P53蛋白含有DNA結合位點及多個蛋白質結合位點，其中F19、W23和L26為P53與MDM2蛋白相互作用所必需，其中F19、L22和W23參與P53與TAF 的相互作用[5]。

2　p53基因功能

p53的細胞內活性作用是介導DNA 損傷后的細胞應急反應，避免受損DNA 的堆積，維持遺傳的穩定性，這主要體現在對細胞周期的阻滯、促進細胞凋亡和DNA 修復。此外，p53 還參與細胞分化、衰老的調節，以及抑制血管生成， 這些功能的完成均依賴于p53 與DNA 相互作用。作為轉錄因子，p53 可以調控下游多種基因的表達。

2.1　對細胞周期阻滯作用

在細胞周期調節中，p53主要監測與轉錄激活作用密切相關的G1和G2/M期校正點[6]。p53下游基因P21(WAF/CIP1)編碼蛋白是一個依賴Cyclin的蛋白激酶抑制劑，一方面P21WAF1與一系列Cyclin-cdk 復合物結合抑制相應的蛋白激酶活性，導致高磷酸化Rb蛋白堆積，后者使E2F轉錄調節因子不能活化，導致G1期阻滯；另外P21WAF1可與PCNA結合，阻斷DNA復制。p53的另外3個下游基因Cyclin B1、GADD45和I4-3-3則參與G2/M期阻滯。p53下調Cyclin B1表達，細胞則不能進入M期，GADD45通過抑制Cyclin B1-cdc2復合物的活性發揮作用，I4-3-3與cdc25c結合干擾Cyclin BI-cdc2復合物發揮錄調節作用[7]。

2.2　促進細胞凋亡

p53可以上調bax的表達水平，以及下調bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用，bax 可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C 的釋放，具有凋亡作用，bcl-2可阻止凋亡形成因子如細胞色素C 等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用。定位于線粒體的NOXA和P53AIPI等基因可直接被p53激活，其過表達能促進凋亡。p53還可通過TNF受體和Fas蛋白等死亡信號受體蛋白途徑誘導凋亡。也有學者認為p53還可直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基來引發凋亡[8]。

2.3　維持基因組穩定性

DNA受損后因錯配修復的累積導致基因組不穩定，遺傳信息發生改變。p53基因的DNA結合結構域本身具有核酸內切酶活性，可切除錯配的核苷酸，結合并調節核苷酸內切修復因子XPB和XPD的活性，參與DNA重組和修復。p53還通過與p21WAF1、GADD45 和PCNA形成復合物，利用自身的3'～5'核酸外切酶活性，參與DNA修復。p53參與DNA 修復過程的另一證據是在DNA損傷后p53能特異性誘導核糖核苷酸還原酶基因的表達，而后者在大多數生物體內調控DNA 錯配后維持基因組的穩定性中發揮重要功能[9]。

2.4　抑制腫瘤血管生成

有研究認為在食管癌中p53基因和VEGF之間有正相關性。p53基因通過調控腫瘤組織中VEGF的表達引起腫瘤血管生成，從而促進腫瘤發生與轉移。在P53+/VEGF+的腫瘤中，其微血管密度(Microvessel density，MVD)明顯增高，且易發生頸淋巴結轉移；而P53-/VEGF-的標本中MVD則較低，則多見于非轉移組中。這些結果表明p53可能通過VEGF調節腫瘤血管生成的途徑[10]。

3　p53基因與食管癌

p53基因是目前已發現的與人類食管癌相關性較高的抑癌基因。在所有的惡性腫瘤疾病中，人類腫瘤組織中有50%以上的p53基因會發生突變，在食管癌的發生發展過程中p53突變和高表達起重要作用，中國醫科院腫瘤醫院赫捷院士等對113對食管鱗癌和正常樣本以及8種細胞系進行外顯子組測序，發現在99%的病例中p53蛋白表達陽性率高達93%[11]。

p53基因與食管癌放化療聯合應用，主要是使用重組人p53 腺病毒(rAd2p53)為載體導入腫瘤細胞內發揮野生型p53基因的功能，p53誘導細胞凋亡是Ad-p53直接的抗腫瘤機制。Ad-p53屬于C組5型腺病毒，主要依靠靶細胞表面的柯薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackie and adenovirus receptor，CAR)與細胞結合。而CAR在人類腫瘤中的表達水平通常比較低，因此阻礙了腺病毒介導的基因轉移和抗腫瘤作用，吳雅瓊等[11]通過研究認為Ad2p53對食管癌細胞的細胞毒性與腺病毒受體的表達基因正相關性。Lu Ping等[13]將45例診斷為食管鱗癌的不能手術或不愿手術的患者隨機分為兩組(rAd2p53+RT(治療組n=22)和RT(對照組n=23))，結果顯示治療組的OR(等于CR+PR)及CR均高于對照組，其CR高于對照組3倍。王少龍等[14]采用隨機單盲法將60例非手術食管癌患者分成單純組(采用劑量60-70Gy的常規分割三野等中心照射)和綜合治療組(單純放療組+tAd-p53瘤體內局部注射每周一次，連續6周；同時配合每周兩次共12次的腫瘤深部熱療)結果的兩組的總有效率OR比較差異有統計學意義，且綜合治療組的嚴重放療毒性反應的發生率顯著降低。崔紅利等[15]利用P53腺病毒注射液聯合替吉奧治療中晚期食管癌，分別在治療4、8、12周觀察療效，其聯合治療組(p53腺病毒注射液聯合替吉奧50 mg，口服，2次/d，d1-14×4)的有效率OR均約比單獨化療組(替吉奧50 mg，口服，2次/d，d1-14×4)高1倍。上述實驗均認為p53基因可增加食管癌對放化療敏感性，提高療效，無明顯副作用，是一種有前景的治療方式，但Tomoki Makino等[16]通過對64位食管癌局部進展(T2-T4)病人行放化療(40-60 Gy，低劑量5氟尿嘧啶+順鉑)前檢測患者p53突變基因和P53免疫組化結果顯示，無論P53免疫組化陽性與否，若患者p53基因突變陽性，則療效極差，故研究者認為放化療前對患者行p53基因突變與否的分析可了解患者的預后情況。

4　p53與其他基因對食管癌的共同作用

有關抗腫瘤基因的研究已從單基因研究進展到了兩個甚至多個基因的研究，miR-34a基因是新近發現并備受關注的miRNA之一，MicroRNA(miRNA)是一種進化中高度保守的不編碼蛋白質的小RNA，主要參與細胞增殖、生長、發育等許多復雜生命過程的調控[17]。在發現miR-34a之前，人們普遍認為參與p53調節網絡的因子均為蛋白質產物。但是當研究人員在激活p53后對細胞中miRNA轉錄情況進行分析后，發現p53能夠顯著地誘導mir-34a的轉錄。這提示了p53基因可能直接地參與了非蛋白編碼基因mir-34a的轉錄調控[18]。mir-34a主要在轉錄后水平抑制靶基因的表達，在腫瘤細胞中mir-34a表達量的減少能夠提高靶基因的表達水平，從而使腫瘤細胞出現異常的增值。mir-34a與p53之間有著錯綜復雜的調控過程，首先p53通過調控許多miRNAs的表達，進而調節細胞周期、誘導細胞凋亡和衰老、抑制腫瘤發生[19, 20]。其次一些miRNAs又通過直接或間接調節p53基因或其上下游基因，參與TP53信號通路的調控，發揮重要的生物學功能[21]，Francisco[22]及龔朝建[23]等認為mir-34a不僅是增強p53表達那么簡單，而是將p53基因的遺傳毒性維持在一個穩健的系統水平，Zhimin等[24]報道，在野生型p53基因背景下，mir-34a的抗腫瘤效應主要是誘導增強p53蛋白及抑制sirt1基因的表達，而Hui等[25]認為在診斷明確的食管癌標本中mir-43a與p53基因沒有關聯性，其可能的原因首先是食管癌中p53基因常常發生突變，還有就是mir-43a基因甲基化。

長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一類長度大于200 nt且不表現出任何蛋白質編碼潛能的RNAs，對全基因組序列分析發現，在lncRNAs中特定的超保守元件與正常細胞的原癌基因有關，和p53基因等一樣具有抑制細胞凋亡的作用。這類超保守元件異常表達可導致細胞發生惡性轉化，引起腫瘤發生這類lncRNAs有H19、hotair、lncRNAs-LET等[26]，而最近對肝癌、膀胱癌研究發現lncRNAs-LET基因在腫瘤細胞中表達下調[27, 28]，同時有研究認為lncRNAs可能通過調節p53信號通路來調節細胞的生長[29]。Wang等[30]通過與正常組織對比發現在食管癌細胞中lncRNAs-LET表達降低，該結果表明LET可能與食管癌的進展及轉移有關。他們認為LET可能也利用該通路誘導腫瘤細胞的生長和凋亡，利用Eca109和TE-1細胞株對比研究發現轉染了LET的腫瘤細胞其p53基因表達顯著增加，所以LET被認為可能激活p53基因的表達從而誘導食管癌細胞凋亡。

5　結語

在我國以鱗狀細胞癌為主的食管癌具有自身的流行病學特點，同時在危險因素、基因譜、發病機制等方面有別于腺癌，但患者預后仍較差，目前仍缺乏最佳的治療方案，新輔助放化療+手術的綜合治療是當前局部晚期食管鱗癌比較公認的標準治療， p53基因是目前發現與食管癌相關性較高的抑癌基因。多年來對p53基因的結構、蛋白質結構及相關功能已經有很深入的研究，同時與lncRNAs、mir-34a等基因的關系也有一定認識，在當前精準醫療的大力倡導下，若要基因治療在臨床廣泛得到應用，讓患者得到個體化治療，無論是基礎研究的還是臨床問題的解決都需要投入大量的財力及精力。

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