線粒體近日節律的研究進展*

應俊杰 李世平 屈藝 母得志

(四川大學華西第二醫院兒科/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

隨著地球的自轉和公轉，我們賴以生存的環境，也呈現出節律性地改變。而對于地球上生存的大多數生物有機體而言，適應自然環境的改變是唯一的生存之道，于是從分子、細胞到機體、群體各個層次上都形成了明顯的時間周期現象，即生物節律。生物節律又分為近日節律、超日節律和亞日節律，這其中最受關注并廣泛研究的是近日節律。近日節律系統調控整個有機體的節律活動，其根本在于生物體內有大量鐘控基因，這些基因又會影響多個信號通路的變化，最終影響生理功能[1]?，F今已經獲得廣泛承認和深入研究的節律基因包括Clock、Bmal1、Per以及Cry等[2, 3, 4]。通過研究這些節律基因的分子機制，形成了經典的負反饋環路調節節律模型[5, 6]，即：光照階段動物視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus，SCN)處Bmal1表達升高，其蛋白產物與Clock蛋白相互結合形成異物二聚體，并從細胞質進入細胞核[7]，與節律基因Per和Cry的表達序列上游e-box元件結合，起始它們的轉錄和翻譯[8]。Per和Cry蛋白又會形成異物二聚體，并抑制Clock-Bmal1異物二聚體活性，使Per和Cry自身基因及蛋白表達下降，解除了對Clock-Bmal1異物二聚體的抑制作用，如此反復循環[9]。

越來越多的研究闡述了新陳代謝和近日節律之間錯綜復雜的關系。一方面，近日節律在各個代謝途徑中扮演了重要的角色；另一方面，一些代謝產物和代謝過程也影響著生物鐘功能。在大量的描述節律和新陳代謝的綜述中，其中一些著重闡明近日節律作用的分子機制[10-13]，另一些則側重研究了節律與代謝的相互影響[14-18]，然而，很少有深入到線粒體層面的研究。線粒體是真核細胞的主要代謝中心，參與了有氧呼吸、脂類合成、鈣平衡等極其重要的生命過程，因此我們可以推測，近日節律與新陳代謝相互影響的過程中，線粒體極有可能在其中發揮了重要的功能。本文搜集了目前在線粒體近日節律方面的研究，通過線粒體組學研究及潛在的功能探究，討論線粒體在哺乳動物體內的節律功能以及線粒體本身具有的節律性。

1 線粒體的自發節律

線粒體的祖先——原線粒體是一種革蘭陰性菌，在15億年前被早期的真核生物吞噬到體內并保留，最終演化為真核細胞的一種細胞器[19]。這一理論被稱為內共生起源學說，認為線粒體曾經是獨立的自由生命體，擁有完整的生存和繁殖機制。然而，在整個進化過程中，它們的一些功能已經丟失或轉移到宿主細胞中，這其中可能包括一些節律與代謝相互調控的功能，那么線粒體在真核細胞中行使節律功能的同時，自身是否還保留了自發節律呢？目前關于哺乳動物體內的線粒體自發節律研究尚待深入，但有人在對酵母菌的研究中發現，“酵母代謝循環”具備近日節律的某些特征，雖然周期往往只有幾個小時[20-21]，但是進一步的檢測發現其線粒體氧化活性也是具有節律振蕩的[20]。酵母菌是最簡單的具有線粒體的真核細胞，但由于酵母菌和哺乳動物的線粒體具有高度的保守性，所以科學家推測線粒體可能具有自發節律，但目前的證據略顯不足，有待研究的進一步深入。

2 線粒體形態學的近日節律

線粒體形態學，主要是研究線粒體由于分裂、融合以及自噬而引起的形態和大小的改變，進而直接影響到線粒體功能。有研究發現，融合的線粒體比分裂的線粒體對底物的利用率更高，其呼吸作用的效率也更高[22]。

早在1981年，電子顯微鏡問世后，Uchiyama Y等[23]就用電子顯微鏡觀察了大鼠肝臟中的線粒體，發現其形狀和體積在光暗周期中有著節律性的變化。而最近的一項研究表明，在小鼠的肝臟中，很多基因都與線粒體形態具有相關性，并且這些基因往往依賴于BMAL1表現出節律性[22]。由此可以推測，BMAL1在線粒體形態改變的過程中，可能處于一個較為核心的地位。于是，為了探究BMAL1在線粒體形態中的功能作用，研究者設計了肝臟特異性敲除Bmal1基因的小鼠并發現，相比于正常小鼠，在敲除小鼠的肝臟中，線粒體在形態上表現的更大更圓，并且線粒體的形態在一天當中不再發生改變[24]。此外，進一步的研究表明，在肝臟特異性敲除Bmal1基因的小鼠體內，線粒體更容易受到氧化應激相關的損傷[24]，由此可見，BMAL1的缺失使線粒體在功能上也發生了異常。

不僅是在肝臟中，在別的組織和器官中，甚至是在體外培養的細胞中，也同樣能觀察到線粒體形態的節律性改變。有研究發現，在小鼠骨骼肌和心臟中，線粒體的形態也會受到節律基因的調控，并且會影響到這些器官功能[25,26]。另有報道發現在體外環境下，巨噬細胞中的線粒體形態同樣受到節律基因調控，并表現出節律性的形態改變[27]。既然線粒體形態上的節律變化與節律基因的調控相關，那么，是否和線粒體自身的基因組有關系呢？然而，近幾年的研究發現，線粒體基因組的總拷貝數在一天中是恒定的，并且不會受到節律基因的調控[24,26,28,29]。

總之，這些研究揭示了線粒體形態變化的節律性，并初步探究了其中的功能影響，對今后研究線粒體節律指明了重要的研究方向，對研究線粒體節律功能具有重要的意義。

3 線粒體組學的近日節律研究

3.1 線粒體蛋白質組的近日節律

線粒體蛋白質組包括了幾百種不同的蛋白質[30]，其中大部分的蛋白是由核內基因組編碼的，通過蛋白通道運輸到線粒體中，只有13種蛋白是在線粒體內轉錄和翻譯的[31]。通過對整個肝臟的蛋白組學進行研究，研究者發現，線粒體中的總蛋白質的豐度在一天中是隨時間變化的[32,33]。近年來，越來越多的研究者眼于單線粒體蛋白組學研究，同樣發現了這樣的變化[34]。事實上，精確到各種不同的蛋白，在線粒體中，超過三分之一的蛋白在一天中都有豐度的變化[34]，并且它們中的絕大多數達到峰值的時間都是在早期光照階段。對線粒體蛋白質組的功能注釋顯示，線粒體主要的代謝和氧化功能相關蛋白表現出晝夜節律振蕩[34]。另外，調控線粒體碳水化合物代謝的丙酮酸脫氫酶復合物(PDC)的幾個組份也是在早期光照階段開始積累的。而控制脂肪酸進入線粒體基質的限速酶-肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1的峰值出現在晚期黑暗階段和早期光照階段之間[34]。

眾所周知，蛋白是由基因轉錄翻譯而來，那么，這些線粒體蛋白的變化是在轉錄水平上就已經發生了，還是在翻譯過程中產生的呢？進一步的研究通過檢測鐘基因敲除的小鼠中的線粒體蛋白發現，幾個核編碼的線粒體蛋白在轉錄水平就已經發生了改變[35,36]。通過ChIP實驗也證明了BMAL1結合在這些線粒體蛋白的啟動子上，這說明BMAL1作為轉錄因子調控了多個線粒體蛋白的轉錄[37,38]。但我們觀察到的線粒體蛋白質具有日常變化也可能同時發生在轉錄后的機制，比如蛋白翻譯的節律性、蛋白的導入或降解的節律性。當然，這方面的研究還只是理論推測，相信在未來的研究中會闡明這其中各種不同的分子機制。

3.2 線粒體蛋白翻譯后修飾的節律性

生物鐘是由一個復雜的分子網絡構成的，它整合了一系列維持生物體內平衡的調節信號。鐘蛋白的翻譯后修飾功能在其中發揮著重要的作用，并被認為可以將生理信號轉化為蛋白質調節功能的變化，進而調控了生物體的近日節律。蛋白的翻譯后修飾調控著蛋白質的穩定性和活性，常見的幾種方式包括磷酸化、乙酰化和泛素化等。目前在線粒體中研究較為清楚的是關于線粒體蛋白乙?；墓澛尚?。Clock基因是晝夜節律起步基因的核心成分之一，它具有組蛋白乙酰化轉移酶(HAT)的活性。所以Clock自然也成為了研究線粒體蛋白乙?；淖钪匾那腥朦c。2013的一項研究通過定量質譜檢測了野生型和Clock缺陷型小鼠的肝臟,發現小鼠肝臟中線粒體的蛋白乙酰化狀態在一天中不同的時間都有所改變。此外，許多代謝途徑中涉及的線粒體蛋白都受到了由Clock調控的乙?；闹匾绊?，包括三羧酸循環以及谷胱甘肽代謝的中的蛋白，都依賴于CLOCK乙酰化位點[39]。這提示我們線粒體蛋白乙?；赡芎凸澛纱x組學也有著重要的關聯，但其中具體的作用還缺乏有力的證據。除了Clock調控的乙?；饔?，Peek等[40]還發現，在野生型和Bmal1-缺陷型的小鼠中，許多線粒體蛋白的乙?；癄顟B也有所不同。例如，脂肪酸代謝酶的乙?；c它們的活性有關，同時也依賴于BMAL1。此外，隨著線粒體呼吸作用的變化，呼吸復合物I的乙酰化水平也呈現出節律性的改變[41]。這些證據都表明，許多線粒體蛋白的乙?；季哂忻黠@的節律性，并在調控線粒體功能中發揮了重要的作用。

其他的線粒體蛋白的轉錄后修飾，如磷酸化，是否同樣具有節律性，也是非常值得深究的問題，雖然現在的研究還處于空白，但相信會有研究者們確定并進一步剖析其在調控線粒體節律性中的功能和作用機制。

3.3 線粒體的脂質的節律

脂質是生物膜的主要組成部分，同時也是線粒體膜的主要成分，決定了線粒體膜的物理性質，以及它們的蛋白質含量。此外, 脂質還是線粒體呼吸作用的主要能量來源，甚至有一些脂質是在線粒體中合成的[42]。最近的一項研究對從小鼠肝臟分離的線粒體應用高通量的脂質性分析，發現線粒體中大約三分之一的脂質表現出具有節律性變化，并且其中的絕大多數都具有近日節律特征[43]。進一步的研究發現，這些脂質節律變化的周期和相位都受到喂養方式(夜間喂食和自由進食比較)及節律基因(per1/2基因敲除鼠和野生型小鼠對比)的影響。在自由進食的小鼠中，它們線粒體的脂質含量高峰出現在光照周期向黑暗周期轉變的過程中，而只在黑暗周期喂食的小鼠，檢測到完全相反的結果。另一方面，在PER1和PER2缺陷型的小鼠中，線粒體中的脂質豐度出現多個峰值，不再表現出節律性，這說明鐘蛋白PER1和PER2在調控線粒體脂質中扮演了重要的角色[43]。另一方面，正如前面部分提到的，線粒體脂肪酸的構成以及它們的代謝也都是依賴于BMAL1完成的[40]。這些都表明了多個節律基因都可能影響了線粒體脂質變化情況，但其具體機制以及與線粒體蛋白質組的相關性還需要進一步的研究。

4 總結與展望

本文從線粒體自身節律，線粒體形態學和組學幾個方面討論了線粒體近日節律的基本調節機制。就目前的研究現狀而言，這幾個方面的研究都有待深入，并不能夠明確地揭示線粒體與近日節律的調控機制；同時，它們之間是否具有一定的相關性，或是一個更為復雜的調控網絡，值得進一步探索。相信隨著人們對近日節律的研究越來越關注，以及對線粒體的研究越來越深入，必定會發現越來越多的證據揭示它們之間的調控關系以及線粒體節律在整個代謝節律中扮演的重要角色。

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