HPV E6/E7與宮頸病變關系的研究進展

李洪瑞 李艷華

(天津海濱人民醫院婦產科，天津 300280)

宮頸癌是全球女性第三大惡性腫瘤[1]。人乳頭狀瘤病毒(the human papillomavirus，HPV感染并不總是發展為癌癥，但90%的宮頸癌病例與高危型HPV的感染有著巨大關系。而這一感染也是宮頸癌患者臨床發病時的重要因素。HPV基因組編碼的E6和E7致癌基因的持續過表達在宮頸癌的發展中具有關鍵作用[2,3]。本文就E6、E7等的致癌機制的研究進展作一綜述。

1 HPV及其致癌機制

HPV病毒是DNA腫瘤病毒，病毒為二十面體對稱的無包膜核衣殼病毒，呈球形，直徑為52～55nm，基因組是雙鏈環狀DNA結構，基因組主要有3各區域，即早期、晚期以及調控區(long conrol region, LCR)。早期區含E1、E2、E4、E5、E6、E7六個閱讀框，分別對相應蛋白進行編碼處理。對于E2編碼的蛋白而言，可對E6以及E7的表達就行控制，并能夠調控病毒的生長，是致癌的關鍵。晚期區域位置在早期區域的下游位置，有兩個ORF可對衣殼蛋白L1以及L2進行編碼。LCR區無蛋白編碼功能。在LCR區中，主要含有HPV病毒復制起點以及多個轉錄因子的結合位點，在HPV復制的早期晚期能夠對基因轉錄調控起到尤為重要的作用。在一些研究中也顯示，早期編碼區域中的E6和E7表達是宮頸上皮內瘤變和宮頸惡性腫瘤發生的重要因素，而E6以及E7則是發病過程中的關鍵點。

正常細胞每分裂一次，染色體縮短50～200bp，當端粒縮短到一定長度時，細胞DNA損傷檢查點被檢測到，并激活p53通路和Rb通路，可致細胞周期停滯，細胞衰老。HPV依靠宿主細胞的復制以維持自身合成過程，HR-HPV DNA中的E1和E2開放閱讀框，并且開始分裂后，在下游的E2、E4、E5、L1和L2等會出現不在表達或是丟失的情況，在此時病毒DNA會被整合到宿主基因中[5]。在整合時，會導致E2蛋白的表達及其活性出現降低，而E6蛋白和E7蛋白的轉錄會上調，在此時會對周期通路以及蛋白造成干擾，導致HPV的持續復制增殖。

2 HPV E6和E7生物學特性及其與腫瘤的關系

幾乎所有類型的宮頸癌均發現了高危HPV DNA，而HPV16是普通人群中最常見的類型[6]。HPV E6導致p53的降解，P53是調節細胞生長停滯的關鍵腫瘤抑制因子；HPV E7結合和失活另一種重要的腫瘤抑制因子——視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，從而干擾細胞周期調控[7]。

2.1 HPV E6及其作用

HPV E6蛋白是通過不典型的鋅指結構2個構成的，每隔鋅指結構均有兩段含有兩個半胱氨酸的氨基酸序列，而這也是所有HPV E6的保守結構。E6蛋白的鋅指狀結構是其許多已知功能所必需的[8]。E6蛋白有許多細胞蛋白的結合位點，這些蛋白包括p53、E6相關蛋白(E6 associated protein, E6-AP)、抑癌蛋白PDZ、p300等，這些蛋白的結合位點對于E6蛋白的功能至關重要[9]。在細胞增殖調控中p53、E6-AP、PDZ和p300都發揮著重要作用，它們通過與E6蛋白結合，使細胞周期發生改變，促進細胞增殖。

p53蛋白是一個重要的抑癌基因，在細胞周期中具有重要的調節作用。當細胞未完成修復時，p53蛋白使細胞停留在G1期，直到DNA完成修復后才能進入S期。當DNA損傷不能得到有效修復時，p53可誘導細胞凋亡。p53主要通過激活細胞周期蛋白激酶抑制因子p21來抑制激酶CDK2的活性，從而阻斷細胞周期的進程。E6-AP蛋白是細胞編碼的一種泛素蛋白連接酶，E6蛋白通過E6-AP介導與抑癌蛋白p53結合，經過泛素途徑使p53、PDZ蛋白最終被蛋白酶體降解而失去功能，破壞p53蛋白的細胞周期調控機制，使細胞繞過細胞周期G1/S和G2/M檢查點，阻止細胞進入DNA損傷應答途徑，使細胞進入S期[10]，而轉向惡性增殖。Hiller等[11]證實，多種高危型HPV類型的E6蛋白均可使p53表達下調，但在低危型HPV6，11，44，54和61中未觀察到這種現象。E6可通過阻斷p53依賴的細胞凋亡途徑阻止細胞凋亡，使基因異常的細胞持續增殖，導致宮頸癌的發生[12]。

E6蛋白可以增強人的端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)活性，E6是通過E6-AP來增強TERT活性。TERT和端粒酶RNA是端粒酶發揮功能的核心成分，分別起提供模板和逆轉錄合成端粒DNA的作用。研究發現，若失去E6-AP結合能力的E6突變體不能提高人的TERT(h TERT)活性；E6-AP敲除鼠研究及人和鼠的RNA干擾研究都證實，E6-AP是E6激活h TERT基因啟動子所必須的[13]。研究表明，HPVE6蛋白可以降低TERT轉錄起始區的甲基化，從而提高h TERT表達[14]。E6蛋白可通過許多途徑激活端粒酶的表達和活性，TERT基因是人端粒酶的限速成分。TERT核心啟動子包含多種轉錄因子結合位點，包括NF-κB、E2F、Sp1等，這些轉錄因子結合TERT核心啟動子能激活端粒酶活性。研究證實，E6蛋白能與myc形成復合物，可以與h TERT啟動子結合，并激活TERT啟動子，而增強TERT表達和活性[15]。E6蛋白能與有活性的端粒酶復合物和端粒直接結合，從而激活端粒酶活性[16]。在惡性增殖細胞中E6蛋白最重要的作用是激活TERT[17]。研究證實，E6蛋白可增強hTERT基因轉錄起始位點甲基化，從而促進TERT基因表達，激活端粒酶[13]。

E6蛋白鋅指結構區的其他蛋白結合位點對于其功能發揮同樣也非常重要的。E6蛋白的C端含有抑癌蛋白PDZ蛋白的結合區域[9]，PDZ蛋白在細胞周期中發揮著重要作用，可以抑制細胞增殖，而E6蛋白可以結合PDZ蛋白使其降解，從而促進細胞增殖。p300/CBP蛋白是轉錄輔助共激活因子，具有組蛋白乙酰化酶(HAT)活性，它在轉錄調控和染色質重塑等中發揮重要作用。p300/CBP蛋白能乙酰化p53蛋白，并激活p53蛋白。E6蛋白結合p300/CBP蛋白可將阻止其乙酰化p53蛋白，降低p53蛋白的活性。

此外，E6蛋白可與多種細胞因子蛋白相互作用，如凋亡調控因子BAK、黏著素樁蛋白、鳥苷酸激酶類似物MAGI-1、-2和-3、基質金屬蛋白酶7(MMP-7)、小G蛋白Rap的GTP酶激活蛋白類似物E6TP1、G蛋白途徑抑制因子2(GPS2)等[18]。

2.2 HPV E7及其作用

E7蛋白是HR-HPV主要的致癌蛋白。E7分為CR1、CR2、CR3三個功能區。E7蛋白N末端的CR1和CR2區在E7蛋白的體外中轉化起重要作用[8]。E7蛋白可與Rb、p130、E2F1、Cyclin A、HDAC等多種細胞蛋白結合。E7主要通過阻止p Rb與轉錄因子E2F結合從而降低pRb活性。pRb是重要的細胞周期調控因子。E2F是細胞增殖所必需的，在細胞周期G1/S轉換及DNA復制中起至關重要作用。細胞周期依賴于CDKs和cyclin的調控，CDKs只有結合cyclins后才具有激酶活性。一般情況下，活性pRb蛋白處于低磷酸化狀態，其與E2F結合，形成特異性pRb/E2F復合物，影響cyclins的表達和CDKs激酶的活性，作為轉錄抑制因子負向調控G1/S期的轉變，可阻止細胞進入S期。而當E7蛋白CR2區的LXCXE結構域與pRb第649-72位氨基酸的口袋結構特異性結合后，pRb與E2F作用受阻，使細胞避免進入DNA損傷應答途徑，不能負向調控G1/S期的轉變，形成不受控的細胞增殖[19]；同樣E7蛋白可以結合CDK2并激活其酶活性。HPV16 E7可通過泛素-蛋白酶體通路降解pRb[20]，使基因異常的細胞發生癌變。p21可通過pRb非依賴性方式抑制E2F活性，而E7能與p21結合使其失活，進而解除p21對CDK2的抑制，也能消除p21對增殖細胞核抗原依賴性DNA復制的抑制功能，弱化p21的雙重抑制作用，而激活CDK2，從而促進細胞增殖[17]。E7蛋白也可使細胞周期相關負向調節因子p16、p27失活，引起惡性轉化。RAS蛋白可以誘導細胞衰老，CR1區含RAS蛋白結合位點，E7蛋白可以與RAS蛋白相互作用，降低其表達，促進細胞增殖。

E7蛋白的C末端有一鋅指結構，能與轉錄因子E2F1結合，激活那些對E2F有應答的啟動子活性。E7蛋白的C端可結合BRCA1，阻止BRCA1對h TERT的抑制作用，促進細胞增殖[21]。CR3區的鋅指結構發生突變，E7蛋白會失去癌變的能力。E7蛋白可增加HAT的表達，并顯著增強E2F上調h TERT啟動子活性，從而促進細胞增殖[8]。

研究表明，E7蛋白持續表達有助于穩定癌細胞端粒酶活性，同時能增強E6蛋白對h TERT啟動子的直接激活作用[22]。E2F可以調控TERT基因的表達，pRb是E2F的主要負調控因子，而E7蛋白可以滅活pRb，從而釋放E2F，故E7可間接激活h TERT啟動子活性，從而激活端粒酶的表達和活性。

E7也可作用于多種細胞因子，如Rb相關p107和p130蛋白，組蛋白H1激酶，TATA框結合蛋白，S4三磷酸腺苷酶，c-Jun，腫瘤抑制因子h Tid1，丙酮酸激酶Mi2，p48，周期依賴激酶抑制物p21CIP1和p27KIP1，IRF-1等[18]

3 其他

3.1 RASSF1A

致癌基因和腫瘤抑制基因都有助于癌癥的發生。HPV16-E6和RASSF1A是已知的致癌和腫瘤抑制基因，對凋亡調節至關重要[23]。RASSF1A是具有高甲基化啟動子的腫瘤抑制基因，參與腫瘤發生，發展和預后[24]。RASSF1A通過其結合和穩定微管的能力誘導凋亡和細胞周期改變，控制有絲分裂和調節基因組穩定性。特異性效應因子包括細胞周期蛋白D1，p120E4F，Cdc20，PMCA4b，Bax，CNK1和Raf1-MST2[25]。HPV16感染和RASSF1A表達在腫瘤發展和進展中起重要作用。研究發現[26]，HPV16-E6通過p53的降解選擇性上調RASSF1A的表達，其與RASSF1A啟動子相互作用并調節凋亡。HPV16感染調節p53介導的RASSF1A表達并抑制細胞凋亡。RASSF1A參與p53依賴性細胞凋亡。

HPV感染和異常Ras相關域家族基因1A(RASSF1A)啟動子甲基化狀態參與宮頸癌的發病機制。一些研究表明[27]，E6和E7參與RASSF1A的致病機制。研究表明，在異位表達HPV16 E6和E7的宮頸癌細胞系中檢測到重新表達和下調的啟動子甲基化狀態；與正常宮頸樣本相比，統計學顯示宮頸癌樣品中RASSF1A的甲基化顯著(P<0.05)。研究表明，RASSF1A基因表達可以通過其啟動子甲基化狀態來調節；HPV16 E6和/或E7的異位表達可能參與RASSF1A基因的異常甲基化和表達。

3.2 EMT

HPV E6、E7癌基因在宮頸癌的浸潤轉移中起重要作用。E6和E7與上皮—間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密切相關。EMT是惡性腫瘤浸潤轉移的重要機制，通過下調黏附分子的表達使細胞間接觸力降低及細胞流動性增強，促進惡性腫瘤細胞遠處轉移。鈣粘素轉換是EMT的關鍵標志，其特征在于E-鈣粘蛋白表達降低，N-鈣粘蛋白或P-鈣粘蛋白表達增加，并且涉及許多侵襲性腫瘤。Hu D等研究中，Pearson相關系數分析顯示，40例高級別宮頸病變中E-鈣粘蛋白表達與E6/E7水平呈強負相關，P-鈣粘蛋白表達與E6/E7水平呈強正相關；此外，該研究表明，HPV-16 E6/E7表達的調控顯著影響細胞增殖、遷移和侵襲，以及宮頸細胞系中E-鈣粘蛋白和P-鈣粘蛋白表達的水平；該研究揭示了HPV-16 E6/E7可以通過調節鈣粘蛋白轉換來提高細胞侵襲潛能，從而有助于宮頸癌的進展和轉移[28]。E6和E7通過激活EMT轉錄因子Slug、Twist、ZEB1和ZEB2，使細胞發生EMT樣改變，增強癌細胞的侵襲力，促進惡性細胞浸潤轉移[29]。同時，E6和E7還可影響宿主的免疫功能，如干擾素應答基因被干擾，E6與干擾素調節因子3結合、E7與干擾素調節因子1結合，抑制干擾素應答啟動，導致病毒逃逸免疫系統的監視，促進腫瘤的進展[30]。

3.3 miRNA

許多致癌miRNA與宮頸癌腫瘤發生相關[31,32,33]。表觀遺傳學不穩定性受到微小RNA(miRNA或miR-)的影響。MiRNA長度為19至25個核苷酸(nt)，并通過結合靶mRNA的3′-UTR而在轉錄和表觀遺傳調控中起作用[34]。眾所周知，miRNA失調與多種人類惡性腫瘤有關，如乳腺癌，肺癌，結腸癌和胃癌[35]。許多miRNAs(miR-9，miR-21，miR-27a，miR-34a，miR-146a，miR-155，miR-196a，miR-203，miR-221等)研究試圖通過不同的方法證實每個miRNA在子宮頸癌中的效用。Ma等研究顯示miR-9通過靶向鈣黏著蛋白1(CDH1)增加細胞運動性和侵襲力，并導致癌癥轉移[36]。Asangani等和Bumrungthai等研究顯示miR-21通過靶向程序性細胞死亡4(PDCD4)促進侵襲和細胞增殖[33]。MiR-155通過靶向肝臟激酶B1(LKB1)促進細胞增殖擴散[32,37]。王曉紅等發現miR-92a和miR-378表達與HPV陽性組織樣本中的癌癥進展相關[38]。劉偉軍等發現miR-9和HPV E6通過下調卵泡抑素樣1(FSTL1)和活化的白細胞細胞粘附分子(ALCAM)mRNA，從而引起細胞運動性增加，兩者均參與細胞遷移[39]。許多研究都報道了miR-21和miR-155與免疫反應以及HR-HPV E6/E7表達相關的其他機制。Bumrungthai等發現miR-21與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和白細胞介素6(IL-6)的表達增加相關，與細胞增殖中PDCD4的表達降低相關；在結腸癌和子宮頸癌細胞中，miR-21通過活化的B細胞(NF-kB)和白介素-6(IL-6)信號通路的核因子κ-輕鏈引發炎癥相關癌變；Asangani等發現在結腸癌中，miR-21下調PDCD4，促進侵襲和轉移[33]。對于miR-155，Guoying Lao等發現miR-155調節LKB1的表達，起到胚胎極性、代謝和細胞生長的作用，miR155的上調促進宮頸癌細胞的增殖[32]。研究發現[40]，與正常宮頸組織相比，三種miRNA(miR-9，miR-21和miR-155)在子宮頸癌組織中的表達均顯著增高(P<0.0001)；miR-21和miR-155是HPV E6/E7陰性子宮頸癌患者7倍和10.3倍高風險的預測因子(分別為P=0.024和P=0.017)，而miR-155是HPV E6/E7陽性患者宮頸癌27.9倍高風險的預測因子(P<0.0001)。在診斷價值方面，miR-21和miR-155的表達與HPV E6/E7 mRNA測定結合有助于獨立于HPV感染的宮頸癌的診斷，因為這些miR-21和miR-155可能能夠鑒別HPV陰性宮頸癌的病例。miR-21與HPV狀態無關，在宮頸癌中持續上調。miR-21和miR-155的表達是HPV陰性宮頸癌組織高風險的預測因子。研究結果表明，特異性miRs的miRNA RT-qPCR檢測可能是診斷宮頸癌，尤其是宮頸癌HPV陰性病例的有用方法。

3.4 Ado

子宮頸癌細胞通過腺苷能途徑抑制細胞毒性T細胞的效應功能。在腫瘤細胞中，CD73的表達在腺苷(Ado)的產生中起重要作用，Ado可以抑制抗腫瘤效應細胞。Mora-García ML等研究結果顯示，HPV+宮頸癌細胞膜表達的CD73水平顯著高于HPV-宮頸癌細胞(P<0.01)；HPV+宮頸癌細胞通過水解AMP產生大量的腺苷；由HPV+宮頸癌細胞產生的腺苷可以抑制CD8+T細胞的效應功能。研究表明，沉默E6/E7表達的宮頸癌細胞中，大大降低了其CD73表達水平和產生Ado的能力。研究提示，HPV感染可能會增加宮頸癌CD73的組成型表達，從而通過大量Ado的產生而抑制免疫應答[41]。在過去幾年中，幾項臨床前研究強調了CD73(ecto-5′-核苷酸酶)作為癌癥治療的潛在治療靶標的價值。實際上，通過單克隆抗體或小分子對CD73進行藥理學封鎖，有望抵消癌癥的發展，成長和傳播。抗CD73藥物與常規癌癥治療(即化療，放射治療，免疫治療，靶向治療)的協同組合具有增加的治療潛力[42]。

3.5 細胞外囊泡

癌細胞釋放的細胞外囊泡是細胞間通訊介質，其有助于癌癥發生。由于它們容易在體液中檢測到，它們也可以用作癌癥生物標志物。Harden ME等研究，檢測一組68個癌相關的miR(MicroRNA)，揭示了許多miR在細胞中和胞外囊泡中具有相似的表達模式，而其他一些miR具有不同的表達模式，并且可以選擇性地包裝入胞外囊泡中。有趣的是，可以選擇性包裝在HPV16E6/E7細胞外囊泡中的miR組被預測可以抑制壞死和凋亡[43]。HPV16 E6和E7癌蛋白表達可改變細胞外囊泡中的微小RNA表達，而抑制壞死和凋亡。

4 展望

宮頸癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，也是目前惟一可以預防的婦科惡性腫瘤，通過早期篩查及干預可以有效地阻止CIN向宮頸癌進展。HPV癌基因E6和E7在宮頸癌的發生和發展中發揮重要作用。宮頸癌篩查的HPV DNA檢測被廣泛用作預防子宮頸癌進展的早期診斷指南。對癌基因表達產物E6和E7蛋白檢測的難度較高，分子檢測技術的研究更多聚焦于癌基因轉錄產物E6/E7 mRNA。由于目前存在一些HPV陰性宮頸癌癌癥病例[44]，因此仍需要研究調查與宮頸癌癌變發生相關的其他分子機制。致癌基因和腫瘤抑制基因都有助于癌癥的發生，HPV E6/E7致癌基因及腫瘤抑制基因等宮頸癌發生發展相關因子的致癌機制及其相互作用的研究也越來越多，各因子具體如何相互影響，在病變發生、發展中所起作用的權重如何，有待進一步研究。