藥物性肝損傷相關的MicroRNA研究進展*

徐艷雯 范蓮 季超毅 徐笑挺 黃逸勛 鄭永霞

(嘉興學院醫學院，浙江 嘉興 314001)

在法醫學領域，損傷時間推斷(dating of wound)一直是國內外學者致力于研究的重點和難點，準確推斷損傷時間可以為案件偵破和審理提供線索和證據。這一領域關注的主要問題是：傷口造成的順序，生前傷還是死后傷，遭受致命傷后的存活時間和受傷是否由意外事故造成。機體損傷后，原本處于穩定狀態的內環境被打亂，必然會發生一些變化，幾乎所有這一領域的關注點都在傷口邊緣活性分子的變化，以期尋找一些與損傷時間有良好相關性的指標，指導法醫學實踐，采用的方法也從單純的形態學檢查發展到蛋白、基因水平。

1 藥物性肝損傷及其發病機制

大部分藥物的代謝發生在肝臟，因此肝臟相較于其他器官也容易受到藥物的損害。某些藥物在肝內經過細胞色素P450藥酶作用，代謝轉化為一些毒性藥物，如親電子基團，自由基和過氧化物，與大分子物質如蛋白質、核酸共價結合或造成細胞質膜的脂質過氧化，破壞了細胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使細胞內外環境的Ca2+穩態破壞，導致肝細胞壞死。除此之外，氧自由基、四氯化碳、氟烷等藥物也可引起肝細胞壞死。另外，其代謝產物也可與肝細胞的蛋白質結合，形成新抗原，誘導免疫反應[3][4]。比如：在特殊類型藥物性肝損傷中，遺傳因素對其產生重大影響。

2 藥物性肝臟損害臨床診斷的問題

在臨床工作中常常運用幾個血清生物標記，如谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素、堿性磷酸酶，幫助識別在臨床試驗中的嚴重藥物性肝損傷事件[5]。然而，這些生物標志物仍然存在假陽性、假陰性的情況，缺乏較強的敏感性，特異性。例如，血清谷丙轉氨酶表達異常不僅與肝臟損傷有關，也可能出現在腎損傷或肌肉壞死的情況中。有些藥物能引起血清轉氨酶升高，但沒有造成嚴重的肝損傷，導致假陽性[6]。這些情況的存在都顯示傳統肝損傷指標作為藥物性肝損傷的生物標志物的局限性。因此，尋找一個對藥物性肝損傷具有高度敏感性，特異性的指標具有必要性。

3 MicroRNA概述

MicroRNAs(miRNAs)是內源性無編碼功能的小分子單鏈RNA，長僅有20～25個核苷酸的單鏈小分子組成。miRNA最早發現于線蟲(Ceanorhadbitis elegans)，這種內源性小分子RNA能夠通過RNA-RNA的相互作用調節特定蛋白的翻譯[1]。后續越來越多的的實驗說明microRNA幾乎具有調控幾乎所有生物學活動的功能而不是單單局限在調控某個生理過程，具體表現為細胞增殖，細胞凋亡，細胞自噬等方面[2]。如今，miRNA已成為重大疾病發生機制和治療策略研究中不可缺少的研究對象。

3.1 與藥物性肝損傷有關的MicroRNA和發病機理

外源性物質的反應可以由肝臟的miRNAs調節。例如，大鼠由于在乙酰氨基酚或四氯化碳等肝臟毒素中的暴露，使得體內多種miRNA的表達發生改變，如miR-298和miR-370的表達下調，它們被認為是調節氧化應激相關基因。在接觸過三苯氧胺后，在大鼠肝臟中檢測到有17-92簇、miR-106a和miR-34升高，它們被認為是致癌miRNA，因此這種情況被認為是患有嚴重的肝癌的表現[7]。另一個研究小組證明了二氧雜芑在環境中無處不在，并在人類和野生動物中積累，改變了miR-101a及其目標環氧合酶-2的表達，它們在肝損傷中起著重要的作用。根據研究發現，在miR-106b抑制表達的患者中，肝毒性藥物氟烷引起Wnt/β-catenin信號轉導通路異常和TOP/FOP熒光比值的顯著上調，導致嚴重的肝損傷[8]。綜上所述，這些研究表明，miRNAs在肝毒性的藥理和毒理學過程中起著重要的作用。正如在miRNAs中所示，通過調控目標基因，可以參與到藥物性肝損傷發展過程中。

3.2 循環miRNAs是藥物性肝損傷的潛在生物標志物

盡管對miRNAs作為生物標志物的研究主要集中在癌癥研究領域，但它們作為毒物生物標志物的潛力最近也得到了研究。在過去的幾年里，許多動物和臨床研究已經發表，表明miRNA比傳統的藥物性肝損傷的生物標志物有優勢。它們是異常穩定的，在病理狀態下具有高度的肝臟特異性和顯著的改變，在體液中很容易檢測到，而且在物種之間是嚴格保守的[9]。因此使用血液循環中miRNAs作為新的藥物性肝損傷的生物標記具有可實行性。比如用于診斷特異性肝損傷時，血液循環中的miRNA-122明顯升高。Wang等[10]在對乙酰氨基酚誘導的肝損傷模型中發現，給藥后24 h，血漿中有44種miRNA的表達水平是對照組的2倍以上，其中25種顯著升高，而miR-122變化最顯著。為了檢測miR-122的靈敏性，他們在給予對乙酰氨基酚不同劑量后1 h和3 h檢測血漿miR-122和ALT的變化，兩者都呈現出劑量和時間依賴性，但對乙酰氨基酚過量暴露引起miR-122的變化更加明顯，而且在亞毒性劑量給藥后3 h和中毒劑量給藥后1 h，就可以檢測到血漿中miR-122的升高，血清轉氨酶卻無明顯變化。

幾個獨立的組織提供了額外的數據支持使用miRNAs作為藥物性肝損傷生物標記。某一組實驗證實小鼠血漿miR-122水平與d-半乳糖胺和酒精引起的肝臟損傷相關。他們還證實，miR-122的變化比谷丙轉氨酶的變化更大，更重要的是，miR-122在肝臟明顯的組織病理學變化之前被檢測到顯著的升高，這表明miR-122可以用于早期診斷和監測疾病。Bala[11]和他的同事發現，血漿miR-122和miR-155在酒精和炎性肝損傷中主要與外泌素含量高有關，而在對乙酰氨基酚引起的肝損傷中，這些miRNAs主要存在于可溶性蛋白含量較高的部分。這些結果表明，循環miRNAs可以作為生物標志物來區分肝細胞損傷和炎癥，而外生或蛋白相關的miR-122可能提供進一步的肝臟病理機制。同一組還比較了40種不同于致命或亞致死劑量乙酰氨基酚的血漿miRNA，發現miR-574-5p，miR-135a，miR-466g，miR-1196，,miR-466f-3p和miR-877在致死性肝毒性的設置中被上調，miR-342-3p，miR-195，miR-375，miR-29c，miR-148a和miR-652明顯下調。因此，人類血漿中miRNAs的差異表達可能有助于區分致命和次等致死肝毒性。

與小鼠相比，大鼠的對乙酰氨基酚所致肝損傷的敏感性較低。使用化學或特殊飲食管理的大鼠模型，Yamaura等人檢查了急性肝損傷(肝細胞損傷或膽汁淤積)和慢性肝損傷(脂肪變性、脂肪肝炎和纖維化)的血漿miRNA水平。他們的結果顯示，miR-122水平比氨基轉移酶的水平更快、更顯著地增加，反映了肝細胞損傷的程度。重要的是，他們的研究還表明，血漿miRNAs的表達譜與肝損傷類型不同，這表明這些miRNAs可能是不同類型肝損傷的特異性和敏感的生物標志物。Su等人[12]還報道，miR-122、miR-192和miR-193有可能成為診斷herb所致肝損傷的敏感、特異性和非侵襲性生物標志物。此外，Starckx和同事證實，在四種具有不同類型和肝毒性作用機制的化合物(乙酰氨基酚、烯丙醇、甲萘基異硫氰酸酯和苯巴比妥)后，在大鼠血漿中miR-122水平顯著升高。小鼠肝細胞的miR-122分泌與其他標志物的反應一致，與谷丙轉氨酶/AST和組織病理學評價所示的肝損傷一致。與其他常規生物標記物相比，血漿miR-122的變化明顯較早，具有廣泛的動態范圍。綜上所述，上述所有發現表明，miR-122有很大的潛力可作為肝臟損傷的生物標志物，并可為評估臨床前研究和開發新藥的肝毒性提供額外的價值。

與小鼠相比，對乙酰氨基酚誘發的大鼠肝損傷的易感性較低。使用經過化學或特殊飲食管理的老鼠模型，Yamaura等人檢查急性肝損傷(肝細胞損傷或膽汁淤積)及慢性肝損傷(脂肪變性、脂肪性肝炎、纖維化)血漿miRNA水平，他們的研究結果顯示，miR-122比氨基轉移酶升高更快、更顯著，反映肝細胞損傷程度。重要的是，他們的研究還表明，血漿miRNAs的表達譜與肝損傷類型不同，這表明這些miRNAs可能是不同類型肝損傷的特異性和敏感的生物標志物。Su等人[13]也報告miR-122、miR-192和miR-193有可能成為診斷herb引起肝損傷的敏感、特異性和非侵襲性生物標志物。此外，Starckx[14]和同事證實，在四種具有不同類型和肝毒性作用機制的化合物(乙酰氨基酚、烯丙醇、甲萘基異硫氰酸酯和苯巴比妥)起作用后，大鼠血漿中miR-122水平顯著升高。小鼠肝細胞的miR-122分泌與其他標志物的反應一致，與谷丙轉氨酶/AST和組織病理學評價所示的肝損傷一致。與其他常規生物標記物相比，血漿miR-122的變化明顯較早，具有廣泛的動態范圍。綜上所述，上述所有發現表明，miR-122作為肝臟損傷的生物標志物有很大的潛力，并可為評估臨床研究和開發新藥的肝毒性提供額外的價值。

4 在人類藥物性肝損傷中循環miRNAs作為生物標志物

據文獻報道外周血循環miRNAs主要來源于凋亡或壞死細胞的主動釋放，以及循環細胞的裂解或是miRNAs被包裹在外核體中經細胞分泌后釋放入外周血，值得注意的是，在肝臟和血漿中共存在約93種miRNAs，其中67種可見于血漿中，55種可見于肝組織中，其中8種在所有人的肝組織中能檢測到，29種在所有人血漿中能檢測到，只有5種在所有人的肝組織和血漿中都能檢測到。Zhang等[15]建立了兩種肝損傷小鼠模型(D-胺基半乳糖和酒精所致的肝損傷模型)來評估肝損傷，在D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型中，早在腹腔注射0.5 h后，就有血漿miR-122的增高，而且所有的小鼠均出現肝臟損傷的病理學變化，但是在此時間點，谷丙轉氨酶的活性并沒有發生改變。酒精所致的肝損傷模型與D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型檢測結果基本一致。而不同的是酒精所致的肝損傷模型中，0.5 h并沒有發現小鼠的肝臟有組織病理學改變，在酒精灌胃更長的時間內才有了肉眼可以觀察到的病理學改變。與常規標志物谷丙轉氨酶相比，在檢測這些類型的肝臟損傷時，miR-122可能是一個更加靈敏的指標，因為miR-122的表達水平改變可能還更先于肉眼可見的組織病理學變化。

Jetten等[16]人也證明了miR-19b和miR-29c在經低劑量乙酰氨基酚治療后在人的血細胞中被上調。然而，谷丙轉氨酶的水平沒有改變。這些結果表明，當肝損害用常規標記無法檢測時，循環miRNAs的表達譜可能會發生改變。事實上，另一項研究顯示，miR-122和高遷移率組1、全長和caspase-cleUNK keratin-18，比谷丙轉氨酶更敏感，更早確定乙酰氨基酚引起的急性肝損傷[17]。Thulin和他的同事還發現，在早期的時間點，血清keratin-18和miR-122的水平顯著升高，而藥物性肝損傷患者的血清keratin-18和miR-122的水平明顯高于谷丙轉氨酶[18]。循環miRNAs因其在肝組織表達的特異、穩定和靈敏而有望成為肝毒性新的可靠的生物標志物。

5 結論

藥物性肝損傷的預測、診斷和管理都是非常復雜的問題。目前的生物標志物或者評估藥物性肝損傷的方法包括生物化學標記，如氨基轉移酶、總膽汁酸、組織病理學或超微結構病理學、活性代謝產物[19-20]，由于敏感性、穩定性或特異性較差，這些常規的毒理學生物標志物無法為肝毒性的早期評價提供準確的信息。新型、可靠、信息豐富的生物標志物的發展，仍然是臨床和臨床前的重要課題。肝臟特異性miRNA-122已被證實參與肝臟發育、分化、代謝和應激反應的各個過程。與常規肝毒性標志物相比，循環miR-122能有效且持續地將肝內損傷與較高的敏感性和特異性區分開來。因此，miR-122有望成為藥物性肝損傷的臨床生物標志物。

雖然使用循環miRNA來早期診斷藥物性肝損傷具有廣闊前景，但在臨床應用前仍需要進一步的研究。要解決的主要問題包括：缺乏大的樣本量進行驗證分析，常規臨床實驗室缺乏檢測方法這些都制約著其進一步發展。總之，使用miRNAs，特別是miR-122，作為藥物性肝損傷的非侵入性生物標志物顯示了巨大的潛力，但仍處于初級階段仍需要對循環miRNAs進行更多的研究，以期真正具有臨床可應用性。