哈氏蜈蚣線粒體基因組全序列分析*

孫麗冉 ，齊迎菊 ，田曉軒

蜈蚣是多足亞門（Myriapoda）唇足綱（Chilopoda）最大最古老的陸生節(jié)肢動物，大約有3 300～3 500種蜈蚣分布在除南極洲以外的每個洲[1]。蜈蚣主要以昆蟲、蚯蚓、蝸牛甚至小脊椎動物為食；因為缺乏蠟質(zhì)的昆蟲表皮，容易失水，通常棲息于森林的葉、樹皮、木材和土壤中[2]。蜈蚣的第一對四肢從身體向前伸展覆蓋口，四肢末端有鋒利的爪子和毒腺。毒腺分泌的毒液不僅可以殺死獵物，也可防御天敵，保護自己的安全。被毒液傷害的人會有局部疼痛，發(fā)紅，腫脹，表面壞死，寒戰(zhàn)，發(fā)熱，虛弱等癥狀，嚴重的繼發(fā)感染甚至會導致人的死亡[3－6]。

蜈蚣作為傳統(tǒng)中藥，主治半身不遂、破傷風、小兒驚風、中風等病[7]，其藥效物質(zhì)主要是脂肪酸、蛋白質(zhì)、酶及膽甾醇等物質(zhì)[8]。其中，神經(jīng)毒素、離子通道作用的成分及毒液過敏原是哈氏蜈蚣毒液的主要成分。純化的哈氏蜈蚣毒液蛋白或多肽具有血小板聚集活性、抗凝活性磷脂酶A2活性、胰蛋白酶抑制活性、電壓門控鉀通道活性等藥理特性[9]。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，蜈蚣可調(diào)節(jié)機體脂代謝，降低血脂，保護心肌細胞及血管內(nèi)皮細胞免受脂質(zhì)過氧化及缺血再灌損傷，增加冠脈血流量。同時，蜈蚣能夠提高人體免疫力，具有改善機體免疫功能和抗衰老功能。除此以外，蜈蚣水提液可增強腸胃功能，且具有一定的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用。體外實驗結(jié)果表明，蜈蚣水提取物對肝癌、腎癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種癌癥細胞有顯著的生長抑制作用[10－14]。

中國供藥用的蜈蚣除藥典收載的少棘巨蜈蚣外，還有哈氏蜈蚣、墨江蜈蚣、多棘蜈蚣等6個物種在中國不同地區(qū)作藥用蜈蚣使用。哈氏蜈蚣（Scolopendra subspinipes dehaani）在分類上屬于蜈蚣目（Scolopendromorpha）蜈蚣科（Scolopendridae），是一種體形較長的（通常為6～20 cm）、毒液毒性較大的蜈蚣[15－16]。哈氏蜈蚣主要分布在廣東、廣西、海南及云南西雙版納等南部熱帶地區(qū)，數(shù)量較少。不同蜈蚣品種間所含藥效物質(zhì)及毒性物質(zhì)不盡相同，對蜈蚣品種的準確鑒定可保證用藥安全，而線粒體基因組序列可為其鑒定提供依據(jù)。

動物線粒體基因組中含有從分子序列到基因結(jié)構(gòu)的所有信息，其基因的組成排列相對保守，可以對許多特征進行綜合比較[17]。且與核基因組相比，線粒體基因組相對較小，易于分析，利于進行基于基因組的進化與生物類群系統(tǒng)發(fā)生的研究[18]，被廣泛應用于動物的系統(tǒng)發(fā)育以及種群保護等領域的研究[19]。本文采用Illumina HiSeq X Ten測序技術(shù)，獲得了哈氏蜈蚣線粒體基因組的完整序列，是國內(nèi)外首個哈氏蜈蚣線粒體基因組的公開報道。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品 哈氏蜈蚣樣品購于廣東佛山，并經(jīng)形態(tài)學鑒定和COI基因分子鑒定確定購買樣品為該物種。Voucher ID為hlwg－1。

1.2 實驗方法

1.2.1 線粒體DNA富集 取新鮮肌肉組織立即使用。利用差速離心的方法富集線粒體細胞器，然后采用酚氯仿抽提法，獲得哈氏蜈蚣總基因組DNA，并使用Nanodrop 2000粗略測定DNA濃度及純度,然后利用 REPLI－g（R）Mitochondrial DNA Kit試劑盒對總DNA進行滾環(huán)擴增，提升線粒體DNA相對于基因組DNA的比例，得到更多線粒體DNA。

1.2.2 Illumina HiSeq X Ten高通量測序

1.2.2.1 建庫 利用超聲波將滾環(huán)擴增產(chǎn)物打斷為特定長度的DNA片段，并在這些片段兩端連接上序列已知的通用接頭構(gòu)建出文庫。

1.2.2.2 Flowcell 構(gòu)建好的文庫通過flowcell時會隨機附著在flowcell表面的channel上，每個channel表面有很多和建庫過程中連接在DNA片段兩端的接頭互補配對的接頭。

1.2.2.3 橋式擴增 橋式PCR以flowcell表面固定的DNA鏈為模板，進行橋式擴增，經(jīng)過變性、退火、延伸的不斷循環(huán)，最終每個DNA片段都在各自的位置上形成簇。

1.2.2.4 上機測序 向反應體系中同時添加包含DNA聚合酶、接頭引物及帶有保護基團和特異熒光的4種dNTP的混合物。在測序過程中，當dNTP被結(jié)合到合成鏈上之后，所有其他未使用的dNTP及DNA聚合酶都被沖洗掉，再加入所需的緩沖液，激發(fā)熒光，記錄熒光信號并轉(zhuǎn)化為堿基信號，然后加入化學試劑淬滅熒光基團及去掉保護基團以便進行下一輪的測序反應。

1.2.3 序列拼接 將測序的原始數(shù)據(jù)從測序服務器上下載至本地，將低質(zhì)量序列、過短序列以及錯誤序列過濾掉得到用于下游分析的序列，根據(jù)目的基因組大小，調(diào)整合適的覆蓋倍數(shù)，使用MIRA 4.0等軟件進行de novo拼接，得到片段較長的contigs，再結(jié)合近緣物種的序列進行mapping組裝，取得質(zhì)量較好的consensus替代近源物種序列，繼續(xù)進行mapping組裝，經(jīng)反復迭代后，進行最高質(zhì)量堿基合意，合意后得到完整線粒體全基因組序列。

1.2.4 注釋分析和提交 通過與近緣種序列進行比較以及MITOS server線粒體在線注釋系統(tǒng)[20]，對全序列進行注釋。以盲蜈蚣科Scolopocryptops sp.（GenBank KC200076）的線粒體基因組全序列為參照，對蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA、rRNA及控制區(qū)等進行注釋，tRNA二級結(jié)構(gòu)由MITOS[12]折疊生成。使用軟件MEGA 4.0及Bioedit等統(tǒng)計哈氏蜈蚣線粒體基因組的序列總長、堿基組成以及GC含量等。完整的哈氏蜈蚣線粒體基因組使用Sequin對各基因進行詳細注釋后，提交到GenBank，登錄號為KY947341。

圖1 哈氏蜈蚣線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The mitochondrial genome structure of Scolopendra subspinipes dehaani

2 實驗結(jié)果

2.1 序列拼接結(jié)果 組裝得到哈氏蜈蚣線粒體基因組后，經(jīng)bowtie2比對[21]，確認共2 557 168條序列（reads）被用于拼接該基因組，這些序列的平均長度為150 bp，測序深度達39 293倍。

2.2 整體結(jié)構(gòu) 哈氏蜈蚣線粒體基因組結(jié)構(gòu)見于圖1與表1。哈氏蜈蚣共編碼35個基因，包括了20個tRNA，13個蛋白編碼基因，2個 rRNA（16SrRNA、12SrRNA）并有1個控制區(qū)。其中除ND5、ND1、ND4、ND4L、16SrRNA、12SrRNA 和 8 個 tRNA（tRNA－Leu、tRNA－Val、tRNA－Gln、tRNA－Pro、tRNA－Cys、tRNAPhe、tRNA－Tyr和 tRNA－His）由輕鏈（L 鏈）編碼，其余21個基因均由重鏈（H鏈）編碼。

2.3 堿基組成 哈氏蜈蚣線粒體基因組全長14 538 bp，其中H鏈的堿基含量為：A=6 085 bp（41.9%），C=2 519 bp（17.3%），G=1 248 bp（8.6%），T=4 686 bp（32.2%），GC=3767 bp（25.9%），A＞T＞C＞G，AT%＞GC%。

2.4 蛋白編碼基因 哈氏蜈蚣線粒體基因組中蛋白編碼基因全10 810 bp，約占全基因組的74.36%。A=4 542 bp（42.0%），C=1 924 bp（17.8%），G=958 bp

（8.9%），T=3 386 bp（31.3%），GC=2 882 bp（26.7%），A＞T＞C＞G，AT%＞GC%。所有蛋白編碼區(qū)均無內(nèi)含子。除ND1以TTG為起始密碼子，ND5和ND4以ATT為起始密碼子，CO1以ACG為起始密碼子,ND2、ATP8、ND3、ND4L、ND6 以 ATA 起始外，其余均使用ATG為起始密碼子。除ND3以TAG為終止密碼子，ND2、COX2、ND1和 ATP8 以 TAA 為終止密碼子，其余蛋白均以T堿基終止，并通過轉(zhuǎn)錄過程中3’端的poly A序列補全，形成完整的TAA終止密碼子。氨基酸使用頻率的分析見于表2。在3 598 個氨基酸中，氨基酸 Cys（1.1%）、Gln（1.8%）和Arg（1.6%）出現(xiàn)頻率較低，而頻率最高的為Leu（14.0%）。

表1 哈氏蜈蚣線粒體基因組表Tab.1 The table of Scolopendra subspinipes dehaani mitochondrial genome

表2 哈氏蜈蚣線粒體基因組蛋白編碼基因氨基酸組成分析Tab.2 The amino acid composition in the protein coding genes on Scolopendra subspinipes dehaani mitochondrial genome

2.5 rRNA和tRNA基因 哈氏蜈蚣的12S rRNA和16S rRNA長度分別為765 bp和1 220 bp，GC含量分別為25.2%和24.9%。tRNA由MITOS[12]注釋生成。20個tRNA基因中，最長的為 tRNA－Ala（anticodon=TGC，80 bp）， 最 短 的 為 tRNA －Asp（anticodon=GTC，42 bp）。

2.6 非編碼區(qū) 哈氏蜈蚣線粒體基因組的控制區(qū)（control region）位于tRNA－Ile與12S rRNA之間，為732 bp。除控制區(qū)外，哈氏蜈蚣線粒體基因組中有6個非編碼間隔區(qū)域，其中最長的間隔區(qū)長46 bp，位于12S rRNA和16S rRNA之間。

3 討論

本實驗中采用差速離心以及滾環(huán)擴增的方法，得到純度較高的線粒體DNA，打斷后進行測序。用這種方法明顯提升測序樣品中線粒體DNA的比例，降低了細胞核基因的影響。相比于從總DNA測序結(jié)果中篩選拼接線粒體的方法[22－24]，該方法對于線粒體DNA的測序深度顯著增加，能夠盡可能降低測序錯誤及假陽性結(jié)果的發(fā)生，得到更準確的線粒體基因組信息。

線粒體基因組具母系遺傳特征，基因結(jié)構(gòu)相對保守，其蛋白編碼區(qū)及tRNA區(qū)結(jié)構(gòu)變化在系統(tǒng)發(fā)育研究中應用較廣[19]。本研究中僅發(fā)現(xiàn)20個tRNA,與蜈蚣目已發(fā)表的其他物種相比[25]，分別在tRNASer與 tRNA－Phe之間缺少一個 tRNA－Glu、在ND1與tRNA－Leu之間缺少一個tRNA－Leu。tRNA的缺失可能是由于tRNA的截斷或其二級結(jié)構(gòu)不對稱造成的[26]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)有多種可能的原因，如：缺少完全配對的受體莖、tRNA區(qū)與蛋白編碼區(qū)或tRNA區(qū)的重疊、不對稱的tRNA序列無法折疊成標準的三葉草結(jié)構(gòu)等。在許多后生動物的線粒體基因組中都有類似現(xiàn)象出現(xiàn)[27－28]。

目前，蜈蚣目中僅有一個物種已發(fā)表線粒體基因組全序列，其近源物種的線粒體基因組研究未見報道。對哈氏蜈蚣線粒體基因組的研究，填補了蜈蚣科線粒體基因組數(shù)據(jù)的空白。未來更多近源物種數(shù)據(jù)的發(fā)表，將為藥用蜈蚣的資源普查及保護提供可靠的依據(jù)。

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