LCZ696對血管緊張素Ⅱ誘導小鼠心肌肥厚的作用及其機制

李曉增，趙凱，潘磊，喬香玲，張青青，李欣

(邢臺市第三醫院，河北邢臺054000)

心肌肥厚是心臟在各種刺激下產生的適應性改變。心力衰竭通常是心肌肥厚的終末病變, 嚴重的心肌肥厚甚至可導致猝死[1]。心肌肥厚形成機制至今尚未研究清楚。信號轉導與轉錄激活因子(STAT)是細胞內一類非受體型酪氨酸激酶蛋白家族，STAT3作為該家族中的重要成員，在胚胎早期發育、腫瘤發生、發展及凋亡等生理病理過程中發揮著重要的作用[2]。國外實驗證明，在STAT3高表達的T3-TG小鼠中，心肌呈向心性肥大等病理改變，提示STAT3在心肌細胞肥大中起重要作用[3]。LCZ696作為第一個在臨床試驗獲得成功的AR-NI類藥物，在抑制血管緊張素受體的同時，能夠加強內源性腦鈉肽的血管舒張作用[4]。然而其對心肌肥厚的作用尚未明確。本實驗于2016年10月～2017年7月，探討了LCZ696對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導心肌肥厚的作用及其與STAT3通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 野生型C57BL/6小鼠(10～12周)60只，購自北京唯尚立德公司生物科技有限公司。人AngⅡ醋酸鹽(Sigma公司生產)；植入式微滲透泵2004(ALZET)泵(美國通用醫療器械公司生產)；乙醚(分析純，廣州試劑廠)；LCZ696(諾華制藥)；AG490(北京大科為生物技術公司);masson三色染色液(北京索萊寶科技有限公司)；STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、tublin抗體(Santa Cruz,美國)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)。HPSSOO型超聲診斷儀;壓力換能器(上海益聯醫學儀器發展有限公司)；佳能EOS1200D單反照相機；Li-COR熒光掃膜儀(美國Li-COR有限公司)；Accurl C6流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 動物分組及其處理 將動物采用完全隨機法分為A、B、C、D組，每組15只。①A組：持續給C57BL/6小鼠吸入乙醚，無菌條件下皮下埋植僅灌注有生理鹽水的ALZET泵，并用縫合線縫合切口；②B組：在無菌條件下稱取AngⅡ(以1 000 ng/kg/min連續28 d的劑量計算)，并溶于200 μL的0．9%生理鹽水，取出微滲透泵，將AngⅡ注入ALZET泵中，無菌條件下將含AngⅡ的ALZET泵埋入皮下，用縫合線縫合切口；③C組：皮下埋入含AngⅡ的ALZET泵的方法同B組，術后1周接受LCZ696(50 mg/kg)治療4次；④D組：皮下埋入含AngⅡ的ALZET泵的方法同B組，術前3 h注射AG490(4 μg/g)1次。待小鼠清醒后，潔凈條件下喂養28 d。

1.3 心功能檢測 小鼠術后28 d時，行超聲心動圖檢測,小鼠持續吸入乙醚進行麻醉，胸部備皮。使用超聲儀，將頻率為5 MHz的超聲探頭置于小鼠左胸進行測量。檢測指標包括左室后壁舒張末厚度(LVPWD)、舒張早晚期的最大血流速度比值(E/A)、左心室射血分數(LVEF)和短軸縮短率(FS)。

1.4 血流動力學檢測 麻醉小鼠仰臥固定后取頸前正中切口，小心分離小鼠右側頸總動脈，行小鼠左心室動脈插管，通過壓力換能器采集監測各組小鼠動脈收縮壓(SBP)、動脈舒張壓(DBP)。

1.5 檢測標本制備 稱取小鼠體質量。頸椎脫臼法處死小鼠，取心臟, 冰凍PBS清洗,稱取小鼠心臟質量，計算心/體質量、心質量/脛骨長度比值，拍攝心臟大體圖片,取部分心肌組織留作凋亡檢測,切取部分心肌組織，甲醛浸泡24 h，做病理切片，行Masson染色，應用ImagePro Plus(IPP)分析軟件于顯微鏡下觀察心肌病理改變。剩余部分立即液氮冷凍, -80 ℃保存。

1.6 STAT3及p-STAT3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。提取各組小鼠心肌細胞總蛋白，通過10%SDS-PAGE行蛋白凝膠電泳，待蛋白完全分離后，將蛋白以80 V恒定電壓轉至硝纖膜上，室溫下用封閉液(1‰Tween20+50 mL 5%BSA)搖動封閉1 h,加入一抗，4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h,TBST洗滌后采用Li-COR熒光掃膜儀避光掃描,顯像后使用Photoshop分析條帶灰度值。

1.7 心肌凋亡檢測 充分研磨心肌組織后，用1 mL PBS沖懸細胞并計數(保證細胞數量不少于105)，1 000 r/min離心5 min，收集細胞,加入400 μL 1×Binding Buffer 輕輕沖懸細胞；加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min,加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min,在30 min內進行流式細胞儀檢測，設定AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 結果

2.1 各組心功能、血流動力學、心/體質量、心質量/脛骨長度比較 見表1。

表1 各組心功能、血流動力學、心/體質量、心質量/脛骨長度比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.2 各組心臟大體圖 與A組比較，B組心臟體積增大，C、D組較B組心臟體積縮小。見圖1。

圖1 各組心臟大體圖

2.3 各組心肌組織病理改變 A組可見少量膠原纖維,散在分布于心肌細胞間隙，B組心肌膠原纖維較A組明顯增加，C、D組心肌膠原纖維較B組明顯減少。

2.4 各組心肌p-STAT3及STAT3蛋白表達比較 A、B、C、D組p-STAT3蛋白表達灰度值分別為44.75±2.14、107.48±8.77、78.20±4.68、46.25±1.46，STAT3蛋白表達灰度值分別為85.46±1.68、87.13±3.08、94.45±2.55、100.86±4.37。與A組相比，B組p-STAT3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C、D組p-STAT3蛋白表達水平明顯降低(P均<0.05)。各組STAT3蛋白表達差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.5 各組心肌細胞凋亡率比較 A、B、C、D組心肌細胞凋亡率分別為2.47%±0.22%、17.04%±4.89%、9.77%±2.11%、11.38%±3.05%。與A組相比，B組心肌細胞凋亡率增加(P<0.05)；與B組相比，C、D組心肌細胞凋亡率減少(P均<0.05)。

3 討論

LCZ696是一種全新研制的藥物，化學結構中包含纈沙坦和腦咖啡肽抑制劑前體AHU377兩種組分。前者為血管緊張素受體阻滯劑類藥物，其比血管緊張素轉化酶抑制劑更安全,可阻斷AngⅡ介導的各種不良作用，在臨床上常用于心力衰竭等疾病的治療[5]；后者為腦啡肽酶抑制劑，其參與了各種內源性血管活性多肽的分解，包括血管緊張素、緩激肽、A、B、C型腦鈉肽等。有研究表明，通過抑制腦啡肽酶活性可影響小鼠血流動力學[6]。LCZ696通過雙重作用機制，在降低心血管病死、心衰住院率等方面有更好的表現[7]。

心肌肥厚是臨床上十分常見的疾病，多種心內科疾病(如原發性或繼發性高血壓、心臟瓣膜病變等)病程中均可呈現心肌肥厚改變。當機體血流動力學過負荷時，心臟機械張力增加[8]，繼而激活機體腎素-血管緊張素系統、一氧化氮合成系統等[9]。機械性與神經體液性因素相互作用，共同誘導心肌肥厚的發生。在心肌細胞肥大的過程中，心肌組織局部釋放AngⅡ，其可以激活心肌細胞表面應力感受器(包括整合素家族等)，從而將刺激信號傳遞至心肌細胞核內[10]。心肌肥厚早期可幫助維持正常心功能, 但長期的心肌肥厚會導致心功能降低、心臟體積增大、心肌順應性降低等不可逆性改變，最終導致心力衰竭[11]。心肌肥厚的病理改變包括心肌細胞肥大、心肌間質細胞增殖、心肌發生纖維化以及心臟細胞外基質改建等。本研究發現，與A組相比， B組E/A、LVEF、FS降低，SBP、DBP增加，心/體質量，心質量/脛骨長度比值增高，心臟體積增大，心肌組織呈心肌肥厚、心肌纖維化病理改變；與B組相比， C組與D組E/A、LVEF、FS增高，SBP、DBP降低，心/體質量，心質量/脛骨長度比值降低，心臟體積縮小，心肌肥厚、心肌纖維化病理改變明顯減輕。提示LCZ696抑制了AngⅡ誘導的小鼠心肌肥厚，其機制可能與抑制STAT3蛋白激活有關。

心臟發生機械牽拉，或當心臟壓力負荷急性增高時，心肌細胞內STAT3激活[12]；另外在心肌細胞增生、肥大的過程中,腎素-血管緊張素等通過自分泌與旁分泌的形式，與心肌細胞表面細胞因子受體或G蛋白偶聯受體結合,受體分子發生二聚化，使得與受體偶聯的JAK2激酶相互接近，并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而活化，激酶JAK2催化STAT3蛋白發生磷酸化修飾，活化的STAT3蛋白以二聚體形式進入細胞核內，與靶基因特定的序列結合，從而改變相應基因的轉錄及蛋白的合成。這些研究均表明，STAT3蛋白通路在心肌肥厚的發生、發展過程中發揮了重要作用。通過本實驗印證了這一結論。另外我們發現，LCZ696可抑制由AngⅡ引起的小鼠心肌細胞STAT3蛋白激活，繼而可能影響其下游基因的激活以及蛋白的表達。

傳統觀點認為心肌屬于永久性細胞，出生后便不能分裂增殖，一旦遭受破壞，則成為永久性缺失，然而有實驗表明，在心臟發育及病理過程中，存在凋亡和增殖兩種變化, 二者的動態平衡維持了心臟功能的穩態。本研究發現，LCZ696可抑制心肌細胞的凋亡,這一作用可能對治療心力衰竭等心臟終末期病變有重要作用。

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