槲皮素對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響及其與KCa3.1的關系

蒲歡，劉應才

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目前，我國動脈粥樣硬化相關心腦血管疾病發病率及病死率居高不下，且支架置入病人也不斷增多[1]。血管平滑肌細胞(VSMCs)異常增殖是動脈粥樣硬化及支架內再狹窄的重要病理生理過程[2]。中電導鈣激活鉀通道(KCa3.1)是由6個跨膜區域組成的非電壓依賴性離子通道，近年來發現其在心室重塑、動脈粥樣硬化等病理生理過程中扮演重要角色[3,4]。槲皮素(Que)是最豐富的膳食黃酮。在心血管方面，Que有抗血小板聚集、降低血壓、調節血脂、防治支架術后再狹窄等作用[5]。已知Que對VSMCs增殖具有抑制作用，但是否通過KCa3.1發揮作用尚不明確。2016年12月～2017年6月本實驗通過培養大鼠VSMCs,觀察Que對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導VSMCs 增殖的影響，并探討其與KCa3.1的關系。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑 清潔級SD大鼠，體質量150～180g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。澳洲胎牛血清(Bovogen)，DMEM/高糖培養基 (HyClone)，Que、CCK-8試劑盒(Sigma)，胰蛋白酶(碧云天)，TRAM 34(Selleck)，KCa3.1 antibody (Abcam)，AngⅡ(大連美侖)，PBS、BCA蛋白濃度測定試劑盒(APSEN)，大鼠Anti-αSMA (博士德)。

1.2 大鼠胸主動脈VSMCs培養及鑒定 采用組織貼塊法培養VSMCs，培養3 d換液1次，5～7 d可見細胞從組織塊游離出，10～14 d組織塊周圍的細胞出現融合，呈波峰波谷樣生長。采用抗大鼠α-SMA 抗體進行免疫組織化學染色鑒定證實為VSMCs。用臺盼藍染色細胞計數法檢測細胞活性。

1.3 實驗分組 在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養VSMCs，待單層細胞鋪滿培養瓶80%以上時采用酶消化法進行傳代。實驗均采用3～5代細胞。實驗先分為：對照組(只加入培養液)、AngⅡ組(10-6mol/L AngⅡ培養48 h)、AngⅡ+ TRAM 34(KCa3.1特異性阻滯劑)組(加入終濃度100 nmol/L TRAM 34預先處理2 h，再AngⅡ培養48 h)、AngⅡ+20 μmol/L Que組(先加入終濃度分別為20 μmol/L Que培養2 h，再加Ang Ⅱ培養48 h)、AngⅡ+40 μmol/L Que組(先加入終濃度分別為40 μmol/L Que培養2 h，再加Ang Ⅱ培養48 h)、AngⅡ+80 μmol/L Que組(先加入終濃度分別為80 μmol/L Que培養2 h，再加Ang Ⅱ培養48 h)、AngⅡ+TRAM 34+80 μmol/L Que (加入終濃度100 nmol/L TRAM 34及80 μmol/L Que培養2 h，再AngⅡ培養48 h)。

1.4 細胞增殖率檢測 采用CCK-8法。選擇對數生長期細胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為1×105/mL的細胞懸液，按10 000細胞/孔接種于96孔板，每孔加100 μL，置于5%CO2培養箱中37 ℃下培養24 h以貼壁。換1%FBS-DMEM培養基繼續培養24 h后，進行加藥100 μL。每組設3個復孔。培養實驗所需時間后所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養箱中孵育1～4 h。使用酶標儀測定450 nm波長下吸光度，以不含細胞的培養基為空白組，按公式計算藥物對細胞的增殖率。細胞增殖率=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.5 Kca3.1通道蛋白表達檢測 采用Western blotting法。用TBS緩沖液潤洗貼壁細胞2～3次。加入適當體積的細胞總蛋白提取試劑于培養瓶內裂解3～5 min。期間反復晃動培養瓶，使試劑與細胞充分接觸。將細胞刮下，收集到1.5 mL離心管中，冰浴30 min，期間用移液器反復吹打。4 ℃ 13 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。制膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠。進行電泳分離(濃縮膠80 V、分離膠120 V)轉膜PVDF膜甲醇活化。按照正負極的方向擺放轉膜“三明治”結構，300 mA恒流轉磨90 min。將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，除去封閉液，加入已稀釋好的一抗4 ℃過夜。回收已稀釋的一抗，用TBST洗3次，每次5 min。加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下搖床上洗4次，每次5 min。用化學發光顯影法進行顯影，以分析軟件Alpha Imager 2200分析產物的光密度值(灰度比值=蛋白條帶灰度/內參照蛋白條帶灰度)。

2 結果

與正常對照組比較，AngⅡ組細胞增殖率明顯增加(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+TRAM 34組、AngⅡ+20、40、80 μmol/L Que組細胞增殖率降低(P均<0.05)。與Ang Ⅱ+TRAM 34組相比，Ang Ⅱ+TRAM 34+80 μmol/L Que組細胞增殖率降低(P<0.05)。與對照組比較，AngⅡ組Kca3.1通道蛋白表達增加(P<0.05)。與AngⅡ組相比，AngⅡ+TRAM 34組、AngⅡ+20、40、80 μmol/L Que組Kca3.1通道蛋白降低(P均<0.05)。AngⅡ+ TRAM 34 +80 μmol/L Que組與AngⅡ+ TRAM 34組相比，KCa3.1表達未見明顯異常(P>0.05)。見表1。

表1 各組VSMCs增殖率及Kca3.1通道蛋白 表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與AngⅡ比較，#P<0.05；與Ang II+TRAM34組比較，&P<0.05。

3 討論

動脈粥樣硬化是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，嚴重危害人類健康，其并發癥已然成為全球負擔[6]。目前認為探索治療動脈粥樣硬化的新方法，將依賴于對疾病過程中主要細胞的生物學特性及致病機制進行嚴格認識。對于VSMCs，未來一個重要目標是確定影響其生物學行為的有益的因素和機制，可以增強或取代傳統的抗動脈粥樣硬化治療。RAAS系統激活是動脈粥樣硬化發病機制之一，AngⅡ通過刺激黏附分子、趨化因子和細胞因子的表達，促進內皮功能障礙、低密度脂蛋白的攝取和細胞增殖等，從而促進動脈粥樣硬化的形成。多種病理刺激可以致平滑肌細胞增殖，RASS系統也在其中發揮重要作用。AngⅡ與細胞表面AT1R結合，從而通過Rho激酶、MAPK、NAPDH/ROS等信號通路，改變一氧化氮、Ca2+濃度，調控miR-221, miR-146a等微小RNA表達及影響各種內源性促有絲分裂因子來使平滑肌細胞發生表型轉變、增殖、遷移、鈣化等[2,7]。目前心血管疾病治療過程中，抑制RASS系統激活已被指南廣泛推薦。

Que是種植物源性五羥基黃酮類化合物。在過去幾十年里，越來越多的證據表明健康飲食中天然來源的雜環化合物對調節人的健康有重要作用。流行病學證據也報道，富含黃酮類物質的飲食有益于心血管疾病的一級預防和二級預防[8]。大量研究表明在動脈粥樣硬化方面，Que可以通過降低血管內炎癥反應、改善內皮功能、抗血小板聚集、降血脂等方面發揮作用[7]。但Que在臨床的應用仍有許多方面困擾著我們，如安全性、生物學形式及生物利用度等。關于Que在人體的安全性問題，大量研究表明Que是安全的，人體攝入1 000 mg/d的Que對血壓、肝腎功、血常規無明顯影響，但其毒副作用仍存在[9,10]。盡管Que作用眾多，但其發揮作用需要特定的生物學形式，而其抑制細胞增殖的多種機制在不同系統是否一致仍需進一步研究。我們仍需更多的基礎、臨床研究及更高的制藥技術來解決這些問題。針對VSMCs，已有研究表明Que可以抑制VSMCs增殖和遷移[5,11]，與我們此次實驗結果一致。在本實驗中，與AngⅡ組相比，Que呈濃度依賴性抑制VSMCs增殖，但具體機制仍需進一步探索。目前，關于Que能否通過KCa3.1來抑制VSMCs增殖的研究較少。

KCa3.1即中電導鈣激活鉀通道，是鈣激活鉀通道家族中的一員。因細胞內Ca2+升高而激活，可促使K+外流，進而調節細胞膜電位和細胞內鈣信號。KCa3.1在參與心血管疾病發生的許多細胞中上調，如激活的T細胞、B細胞、巨噬細胞、血小板、VSMCs和成纖維細胞，提示其可能在動脈粥樣硬化、再狹窄和心臟纖維化等發生中起作用[3]。近年來相關研究已表明分化狀態、靜止、收縮表型的VSMCs優勢表達KCa3.1。但在血管增生性疾病，在許多炎癥因子、剪切力、氧化應激等作用下，VSMCs發生表型調整，KCa3.1快速上調，從而介導其生物學行為的改變[3,12,13]。KCa3.1能否作為一個治療動脈粥樣硬化及其他心血管疾病新的靶點正在進一步研究。且在阻斷該離子通路對小鼠未產生毒副作用，也不影響其對流感病毒的免疫反應，且未在小鼠及服用KCa3.1阻滯劑Senicapoc的人上觀察到對血壓影響[14]，這些使這個通道臨床應用成為可能。而我們的研究也表明，與對照組相比，AngⅡ刺激下KCa3.1通道蛋白明顯增加。而加入KCa3.1特異性阻滯劑TRAM 34后VSMCs增殖明顯被抑制，因此，抑制KCa3.1通路將抑制VSMCs增殖。在本次試驗中，我們繼續探討Que抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖是否與KCa3.1有關。結果發現，Que能抑制AngⅡ誘導的Kca3.1通道蛋白的增加，而KCa3.1特異性阻滯劑TRAM 34能消除這種作用。Ang Ⅱ+TRAM 34+80 μmol/L Que組與Ang Ⅱ+TRAM 34組相比，兩組的細胞增殖有差異性，說明表明Que可以通過抑制KCa3.1來抑制VSMCs增殖，但并不是其唯一的機制。

綜上，Que可以通過調控KCa3.1來調節VSMCs增殖。目前隨著制藥工藝的進展，使Que生物利用度的提高成為可能，深入研究Que在參與動脈粥樣硬化的各類型細胞中的作用有助于運用其防治動脈粥樣硬化。

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