大蒜素對骨肉瘤獲得性耐藥細胞株的作用及其機制

李季，蔡錦芳，鄒林，李宗玉

(1鄭州市第一人民醫院，鄭州450004；2濟南軍區總醫院)

骨肉瘤是兒童、青少年最常見的骨科惡性腫瘤，也是導致此年齡段患者病死的最主要原因之一。近年來，在外科手術及新輔助化療方面已經取得了巨大進展，然而骨肉瘤患者的生存率并沒有提高[1]。骨肉瘤具有侵襲性強等惡性生物學特性，對化療藥物耐藥性的產生是導致骨肉瘤治療失敗的最主要原因[2]。近年來的研究證實，中藥及其提取物在逆轉耐藥方面具有很好的應用前景[3]。流行病學研究證實，大蒜提取物具有預防、治療腫瘤的功效[4]，大蒜提取物中含有大量的含硫化合物，其中二稀丙基三硫化物即大蒜素(DATS)占50%～80%，其次是二烯丙基二硫化物和二烯丙基一硫化物[5]。DATS具有降血壓、抗感染、免疫調節以及抗腫瘤等功能[6]。有研究證實，非細胞毒性劑量的DATS能夠逆轉骨肉瘤U2-OS細胞中P-糖蛋白(P-gp)介導的多藥耐藥性[7]。2015年6月～2016年12月，本研究擬探討DATS對阿霉素(DOX)獲得性耐藥骨肉瘤細胞株的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤Saos-2細胞株購自中科院上海細胞庫，DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素、DOX及DATS購自大連美侖生物技術有限公司，MTT溶液購自上海哈靈生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自杭州邦易化工有限公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，pERK1/2(sc-16981-R)、ERK1/2(sc-101761)、pAKT1(sc-293125)、AKT1(sc-7126)和內參GAPDH(sc-47724)一抗均購自美國Santa公司，羊抗兔、兔抗鼠二抗購自南京金斯瑞生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光液購自美國Thermo公司；酶標儀(ELx800)購自美國BioTek公司，凝膠成像儀(GelDoc2000)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 耐藥細胞株的構建 采用間歇刺激法誘導骨肉瘤Saos-2細胞的耐藥細胞株，細胞生長于DMEM培養基(含10% FBS，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。高濃度DOX[經查閱文獻[8]，并經MTT試驗驗證：DOX對Saos-2細胞的半數抑制濃度(IC50)值為(125.76±5.79)μg/L，故該濃度對于細胞屬高濃度]200 μg/L作用于對數生長期的Saos-2細胞，4 h后撤藥，正常DMEM培養液進行培養，每周刺激1次，6個月內共刺激了12次，建立的耐藥細胞株命名為Saos-2/DOX。

1.3 細胞生存率的檢測 采用MTT法。以0.8×104/孔的密度接種于96孔板，細胞貼壁后換成無血清DMEM培養液，撤血清24 h，使細胞周期同步化，分別以含不同濃度的DOX或DATS完全培養液培養細胞，每個濃度設置6個復孔，24、48、72 h時檢測細胞生存率。具體方法為：每孔加10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h，棄掉上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩、溶解，于酶標儀上測量490 nm波長吸光度值。取每組6個復孔的吸光度值的均數，計算細胞生存率，即加藥組吸光度值與未加藥組吸光度值的比值。重復3次試驗后，進行統計分析。IC50值，即細胞生存率為50%時所對應的濃度，耐藥指數(RI)=耐藥細胞的IC50/親本細胞的IC50。

1.4 pERK1/2、ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組約1×107個細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，分別加入pERK1/2、ERK1/2、pAKT1、AKT1和內參GAPDH的一抗，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔或兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h，加ECL發光液進行化學發光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對圖像進行灰度分析，記錄灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值。重復3次試驗后，進行統計分析。

1.5 觀察指標 不同濃度DOX(0、10、100、200、400、800、1 600 μg/L)分別處理Saos-2和Saos-2/DOX細胞48 h后，MTT法檢測細胞存活率，計算IC50和RI值；不同濃度DATS(0、10、50、100 μmol/L)處理Saos-2/DOX細胞，24、48、72 h后，MTT法檢測細胞存活率；DOX 100 μg/L與DATS 10 μmol/L 單獨或聯合處理Saos-2/DOX細胞，24、48、72 h后，MTT法檢測細胞存活率；不同濃度DATS(0、10、50、100 μmol/L)處理Saos-2/DOX細胞，48 h后，Western blotting法檢測pERK1/2、ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達情況。

2 結果

2.1 Saos-2/DOX耐藥細胞株的鑒定 不同濃度DOX分別處理Saos-2和Saos-2/DOX細胞48 h后， Saos-2的IC50值為(125.76±5.79)μg/L，Saos-2/DOX的IC50值為(873.27±9.16)μg/L，Saos-2/DOX細胞的RI值為6.94，說明Saos-2/DOX為DOX的穩定耐藥細胞株(RI值>3即為耐藥細胞株[8])。見表1。

表1 不同濃度DOX處理48 h后Saos-2和Saos-2/DOX 細胞生存率的變化

2.2 DATS對Saos-2/DOX耐藥細胞株增殖的影響 不同濃度DATS處理Saos-2/DOX耐藥細胞，24、48、72 h后，DATS對Saos-2/DOX細胞具有生長抑制作用，且呈時間和劑量依賴性，見表2。其中，低濃度DATS(10 μmol/L)處理Saos-2/DOX細胞24 h后，細胞存活率為94.62%±1.85%，可視為非細胞毒性濃度，用于后續試驗研究。

表2 不同濃度DATS處理后各時間點Saos-2/DOX細胞 生存率的變化

注：與0 μmol/L DATS相比，aP<0.05；與10 μmol/L DATS相比，bP<0.05；與50 μmol/L DATS相比，cP<0.05；與24 h比較，#P<0.05。

2.3 不同時間點DATS、DOX單獨或聯合處理后Saos-2/DOX細胞生存率比較 DOX 100 μg/L處理Saos-2/DOX耐藥細胞24 h后細胞存活率與DATS 10 μmol/L處理后差異無統計學意義(P>0.05)；DOX 100 μg/L與DATS 10 μmol/L聯合處理Saos-2/DOX耐藥細胞24 h后細胞存活率顯著低于DATS 10 μmol/L或DOX 100 μg/L單獨處理，且隨處理時間延長逐漸降低(P均<0.05)，見表3。

表3 不同時間點DATS、DOX單獨或聯合處理 Saos-2/DOX細胞生存率比較

注： 與DOX 100 μg/L比較，aP<0.05；與DATS 10 μmol/L比較，bP<0.05；與24 h比較，#P<0.05。

2.4 不同濃度DATS 處理48 h后Saos-2/DOX細胞中pERK1/2、ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達比較 不同濃度DATS處理Saos-2/DOX細胞48 h后， ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達變化差異無統計學意義(P均>0.05)，而pERK1/2蛋白表達水平隨濃度增高顯著增加(P均<0.05)，見表4。

表4 不同濃度DATS處理48 h后Saos-2/DOX細胞中pERK1/2、 ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達比較

注：與0 μmol/L DATS相比，*P<0.05。

3 討論

骨肉瘤嚴重威脅兒童、青少年的生命健康，且80%患者就診時已發生腫瘤轉移，其中以肺轉移最常見[9]。目前，根治性手術仍然是臨床上最常用的治療手段，然而僅接受根治性手術的患者術后預后并不樂觀，5年生存率僅15%～20%。術前給予患者8～12周新輔助化療(如大劑量DOX)，能夠顯著提高骨肉瘤患者的術后5年生存率和生存質量[10]，但對化療藥物耐藥性的產生，導致骨肉瘤患者的長期生存率降低，因此，尋找能夠有效逆轉化療耐藥的方案，是骨肉瘤相關研究的難點和熱點。

蒽醌類抗生素是近三十年來研究較多、發展較快的一類抗腫瘤藥物，其中DOX被廣泛應用于實體腫瘤和血液腫瘤的臨床治療。DOX主要通過抑制DNA復制，導致DNA損傷從而誘導細胞凋亡，殺傷腫瘤細胞，發揮抗癌藥效。然而，長期應用DOX可導致獲得性耐藥、劑量依賴性的不可逆嚴重心臟毒性等[11]，嚴重制約了DOX的臨床應用。

有研究發現，細胞中P-gp蛋白表達增加是導致骨肉瘤耐藥性產生的重要原因[12]。近年來，大量研究對此結論進行了驗證和深入探討，如Li等[13]的體外研究發現，抑制DNA-PKcs導致P-gp表達下降，能夠增強骨肉瘤腫瘤干細胞對化療藥物的敏感性；此外，有研究顯示DATS可逆轉骨肉瘤細胞中P-gp介導的多藥耐藥性[7]，但并未對其他可能的DATS逆轉耐藥機制進行深入探討。

本研究采用間歇刺激法成功構建對DOX耐藥的骨肉瘤細胞株Saos-2/DOX，其RI值為6.94，且實驗證實，DATS具有抑制Saos-2/DOX細胞增殖的作用，呈現時間和劑量依賴性，其中10 μmol/L DATS干預細胞24 h后，細胞存活率為94.62%±1.85%，可視為非細胞毒性濃度，用于后續試驗研究。100 μg/L DOX干預細胞24 h后，細胞存活率為98.38%±2.04%，而DOX 100 μg/L與DATS 10 μmol/L聯合處理Saos-2/DOX耐藥細胞24 h后，細胞存活率為69.65%±5.69%，顯著低于DATS或DOX單獨處理組，且此效應具有時間依賴性。以上實驗結果提示，非細胞毒性濃度的DATS能夠逆轉Saos-2/DOX耐藥細胞對DOX的耐藥性，增加化療敏感性。

DATS能夠抑制Saos-2/DOX耐藥細胞增殖，而ERK1/2和PKB/ AKT1是兩條非常重要的細胞內信號通路，與腫瘤細胞異常增殖密切相關[14]。本研究采用不同濃度DATS干預Saos-2/DOX耐藥細胞48 h后，Western blotting法檢測細胞中ERK1/2、AKT1蛋白及其活化狀態的pERK1/2、pAKT1蛋白表達水平變化情況，結果發現ERK1/2、pAKT1和AKT1蛋白表達并無變化，而pERK1/2蛋白表達水平則顯著增加，且呈現濃度依賴性，以上結果提示，DATS抑制Saos-2/DOX耐藥細胞增殖、逆轉DOX耐藥可能是通過促進ERK1/2蛋白激活實現的。ERK1/2在結腸癌、鼻咽癌等不同腫瘤細胞中均參與調節細胞增殖過程，并且在結腸癌、肺癌細胞中均有關于DATS促進ERK1/2蛋白活化的報道[15]，以上研究均證實DATS能夠顯著增強ERK1/2磷酸化水平，進而促進ERK1/2蛋白激活，與本研究結果一致。

綜上所述， DATS能夠抑制Saos-2/DOX耐藥細胞增殖，且具有時間和劑量依賴性，非細胞毒性濃度的DATS能夠逆轉Saos-2/DOX耐藥細胞對DOX的耐藥性，增加化療敏感性，且可能是通過增強ERK1/2磷酸化水平激活ERK1/2信號通路實現的。

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