環介導等溫擴增(LAMP)技術的研究進展與展望

杜芳玲，王婷婷綜述；劉洋，萬臘根校審

(1、南昌大學公共衛生學院，江西 南昌 330006；2、南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330006)

1 LAMP技術特征

1.1 LAMP原理 環介導等溫擴增技術針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件下（65℃左右）保溫約60min，即可完成核酸擴增。

1.2 擴增產物的檢測方法 目前應用較廣泛的有以下三種方法：⑴目測或濁度檢測：通過對擴增過程中產生的副產物-焦磷酸鎂沉淀來檢測判斷有無擴增產物；⑵熒光檢測：在反應液中加入SYBR GreenΙ，可在紫外燈下通過肉眼判定；⑶電泳檢測：由于擴增后的產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜結構的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯示不同大小區帶的階梯式圖譜

1.3 LAMP的技術特點 ⑴快速、高效。不需要預先的雙鏈DNA的熱變性，避免了溫度循環而造成的時間損失。⑵高靈敏度。對某些病原體的擴增，模板只要幾個拷貝數，與PCR相比高出幾個數量級。⑶高特異性。針對靶序列的6個區域設計的4種特異性引物，6個區域中如有一處與引物不匹配均不能進行核酸擴增。⑷產物檢測方便。LAMP在合成DNA的過程中會產生大量的焦磷酸根離子，能與鎂離子結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，因此可以根據反應體系中是否生成白色沉淀來判斷反應的進行情況。⑸操作簡單。LAMP反應只需要一個簡單的恒溫器，水浴鍋、金屬浴均可完成此實驗，并不需要昂貴的儀器，可操作性強。

2 研究進展

2.1 難培養病原微生物的檢測 由于傳統病原微生物的分離、培養、鑒定往往操作程序繁瑣，等待結果時間較長，而LAMP克服了這些缺點能在傳統培養病原微生物檢測中發揮優勢。與此同時，部分致病菌受培養條件的限制而不易檢出，則更促進了LAMP技術在這類難培養病原體的檢測取得了較大進展，已出現很多報道。

結核分枝桿菌采用固體培養基分離培養耗時長易混入其他細菌，直接涂片染色鏡檢極易漏診，因此IWAMOTO[1]等根據gyr B基因序列設計針對結核分枝桿菌的引物，用LAMP方法從痰標本中鑒定結核分枝桿菌，通過檢測24株分枝桿菌和7株非分枝桿菌證實了LAMP法的特異性和敏感性。劉暢[2]等針對艱難梭菌毒素A基因設計引物建立LAMP法與熒光定量PCR對比，驗證其靈敏度和特異度。SEKI[3]等在肺炎鏈球菌的特異性基因序列lytA上設計6條引物，用LAMP法檢測10株肺炎鏈球菌和6株非肺炎鏈球菌驗證其特異性，并發現LAMP較PCR法檢測肺炎鏈球菌敏感1000倍，具有潛在診斷價值。

2.2 非培養病原微生物的檢測

2.2.1 DNA病毒與RNA病毒的檢測 ⑴對RNA病毒的檢測臨床上SARS-CoV的檢測方法主要有兩種，一種是檢測SARS-CoV抗體，雖然這種方法的敏感性較高，但需在發病10d后才可檢出；另一種方法是定量PCR，這種方法可在發病早期檢出SARS-CoV，但是需要復雜的儀器和昂貴的試劑，不便于在SARS暴發時進行常規檢查。Hong等[4]根據LAMP的原理設計了實時定量逆轉錄LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍，最低檢測極限是0.01 PFU，表明在臨床檢測中具有明顯的優勢。Poon[5]等采用PCR和LAMP來擴增甲型流感病毒的RNA，其中LAMP反應條件是在60℃的恒溫下反應2h，而PCR實驗中，反應需進行35次循環。每一反應結束后，以瓊脂電泳分析法來測定各反應靈敏度發現LAMP為PCR的10倍以上。

⑵對DNA病毒的檢測 Enomoto[6]等利用LAMP技術設計了單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2的特異性引物來擴增HSV-l和HSV-2基因，敏感性達到500-1000拷貝/反應管。Odari等[7]針對HIV-1型整合酶基因設計引物，用LAMP方法對HIV-1型M亞型組病毒載量進行半定量，定量最低限度為9800拷貝/ml，該研究表明LAMP作為半定量測定病毒載量的方法具有一定應用價值。但是，在驗證擴增產物中非靶基因產物上還須進一步提高引物特異性。

2.3 其它病原體的檢測 除了常見病原體檢測外，LAMP技術在原蟲、真菌等方面的應用也較傳統的培養法、ELISA及PCR法上具有明顯優勢，應用較為廣泛。Zhao F[8]等采用LAMP方法檢測臨床上12例常見呼吸道病原體和39例肺炎支原體DNA，并與PCR和實時PCR對比驗證，發現靈敏度和特異度均較高，檢測下限為102拷貝。

Shirzad Fallahi[9]等針對弓形蟲的RE和B1片段作為靶基因設計引物，用LAMP方法檢測白血病兒童血液中的弓形蟲，發現LAMP的靈敏度和特異度均比巢式PCR高，且B1作為靶基因采用LAMP在免疫力低下患者標本中檢測弓形蟲具有很高的診斷價值。

真菌是引起食物中毒常見的微生物，黃曲霉素是真菌中毒性極強的劇毒物質，但其分離培養周期長，Liu等[10]提出用LAMP快速檢測食品中黃曲霉素的方法，檢出率達100%，表明可能是一種檢測黃曲霉菌保證食品安全有效途徑。

LAMP還可應用于乙型肝炎病毒 (HBV)[11]、流感病毒(H1-H3)[5]、水痘帶狀病毒(VZV)[12]、假結核耶爾森氏菌[13]、人類皰疹病毒7[14]、瘧原蟲[15]等病原體的檢測以及動物胚胎性別鑒定[16]。

2.4 耐藥性檢測 近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥率在不斷上升，對耐藥基因的檢測已成為全球關注的熱點問題。王歡[17]等針對銅綠假單胞菌OprD2耐藥基因設計兩對引物，利用LAMP進行快速擴增。加入核酸染料HNB直接肉眼判讀結果，檢測和分析了47株銅綠假單胞菌OprD2耐藥基因的分布情況及其與抗生素耐受性的相關性。該方法的靈敏度比常規PCR高10倍，檢出率(51%)與PCR檢出率相當。適用于直接檢測臨床標本中銅綠假單胞菌的耐藥基因以指導臨床用藥。李秀梅等[18]在金黃色葡萄球菌的新霉素耐藥基因aph保守區設計一套特異性的引物，結果表明LAMP靈敏度與PCR相當，檢測限約20個拷貝。

Solanki等[19]對產碳青烯酶的革蘭陰性菌株的blaNDM-1和blaKPC基因設計引物進行LAMP藥敏試驗，對比普通PCR和表型驗證試驗結果，認為LAMP在耐藥基因檢測方面有潛在應用價值，這也給臨床提供了一種檢測質粒介導的碳青霉烯酶新型快捷又簡便的有效檢測方法。

2.3 基因分型等的應用 此外，LAMP在基因分型、腫瘤轉移生物標志物檢測等方面也有報道。最近有證據表明藥物副作用的發生率和人類白細胞抗原(HLA)等位基因型有密切關系。因此Cheng等[20]利用環介導等溫擴增技術鑒定HLA-B1502，取得了良好的效果。分別用LAMP、基底序列(SBT)和PCR的方法檢測450例樣本的B1502狀態。最終LAMP與SBT和PCR符合率為100%。研究證實，LAMP可以用于檢測HLA基因分型，且成本低、時間短，能夠有效解決臨床實際困難。

2.4 流行病學研究 楊俊發[21]等利用LAMP方法對肺部非典型感染進行病原學檢測，發現在肺部非典型感染早期病原學檢查和前瞻性指導中具有很好的潛在應用價值。同時采用LAMP技術對嗜肺軍團菌引起的社區獲得性重癥肺炎的常見病原體診斷進行回顧性研究[22]，認為LAMP方法準確、快速、經濟，可為臨床早期抗生素治療提供病原學依據。

2.5 LAMP相關衍生技術 為充分利用LAMP技術的優勢，擴展其應用范圍、提高檢測的效率及可靠性，近年來，在LAMP技術的基礎上已衍生出很多相關的基因檢測技術，包括實時LAMP(real time-LAMP)、HtL-LAMP、 多重LAMP和原位 LAMP技術等。實時定量LAMP檢測避免了反應管的開管，便于對擴增體系進行優化，也利于對靶標分子進行定量檢測，其中應用最廣的有濁度儀檢測[23]以及生物發光[24]等實時檢測法。LAMP可與芯片技術相結合實現對大量樣本的高通量快速檢測。Britton S等[25]利用此方法檢測多個地區的大量臨床標本中的惡性瘧原蟲，基于顏色變化判讀擴增結果，結果靈敏度較高，特異性較PCR低，有應用價值，目前技術不成熟，LAMP實現高通量的能力還受到一定限制。

2003年Maruyama[26]等將LAMP和原位雜交相結合，建立了原位LAMP(1n-SituLAMP)，用于檢測組織細胞中的E.coli O157：H7。同原位PCR相比，其優點是使用相對較低的溫度，可減少細胞的破壞，有利于同步應用熒光抗體進行細胞鑒定。

多重LAMP擴增，即反應體系中混合有多組擴增引物進行擴增反應，實現同時對不同靶序列的擴增反應。2006年申建維[27]等將核酸雜交和LAMP技術結合來檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌耐藥基因meca和fe-mA通過多重LAMP擴增，加入2種不同熒光探針分別與meca和femA基因的擴增產物互補結合，最后檢測反應管中的2種熒光值。結果該方法的最低檢測限為10CFU/ml，與藥敏試驗結果相比較，靈敏度99.0%，特異度90.9%，證明該方法檢測靈敏、特異性高，操作簡便快速，適用于臨床樣品的直接快速基因檢測。此次試驗的創新之處在于將核酸雜交與LAMP相結合，利用不同熒光探針進行標記，大大提高了對擴增產物檢測的特異性和靈敏度。盡管如此，由于加入的引物數目較多，容易導致引物二聚體的形成，從而加劇引物來源的非特異擴增問題。此外LAMP使用的DNA聚合酶具有一些特殊的性質如鏈置換活性，可能出現產物量大、分子量高或仍呈現梯形分布的非特異擴增產物。

3 展望

3.1 方法局限性 LAMP在基因擴增方面具有很大優勢，但是卻一直很難在臨床上得到廣泛應用，主要可能有幾個原因。⑴對靶序列和引物的長度有很高要求以確保特異性擴增，在引物設計上難度較大。⑵反應結果只有擴增和不擴增兩種，一旦出現非特異性的擴增，則不易鑒別。⑶由于方法靈敏度高，在檢測過程中由于加樣、EP管的開蓋、氣溶膠的形成等極易發生污染，導致假陽性的結果。大量研究推薦使用濁度計等不開蓋方法檢測擴增產物。但這類措施并不能在根本上解決假陽性率高這一問題，可能還會存在非特異性擴增。此類非特異擴增產物的出現與引物序列性質、反應時間長短有關系，且通過引物篩選、反應時間優化能很大程度上降低其產生幾率，但這無疑影響了LAMP法作為檢測診斷技術的可靠性，限制了技術的臨床推廣。

3.2 與其他方法聯合應用 近年衍生出的多重LAMP擴增技術——微型擴增技術，以其實現多個平行、互不干擾的小體積單重擴增的技術優勢成為研究熱點，這些技術聯合應用ELISA[28]、熒光免疫[29]、化學發光[30]等免疫方法，具有試劑消耗少、自動化程度較高、交叉污染風險更小以及更適合對較多靶標進行現場快速檢測。如Ge等[31]將LFD用于LAMP產物檢測時，利用FITC和生物素基團分別標記兩對環引物和固相抗體，通過顯色反應判斷結果。這種方法操作簡單快速，提高特異性和靈敏度，但需要開管暴露擴增產物，易造成擴增產物污染，且引物的標記會提高檢測成本，適用性不大。2011年Wang等[23]將磁珠芯片與LAMP整合，在1h內成功檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。Mei-Feng Lee[32]等基于LAMP方法聯合PCR、ELISA和熔解曲線分析法設計了LAMP-TMELISA法對結核桿菌的多個耐藥基因突變位點進行檢測，確定多重耐藥結核桿菌（MDR M.tuberclosis），從而指導臨床用藥。

3.3 應用前景 目前，LAMP檢測技術已經實現產品化，日本Eiken公司網站已經開發了包括禽流感、SARS、西尼羅河病毒、牛胚胎性別檢測等19種LAMP檢測產品試劑盒出售。我國也已有十幾種LAMP檢測試劑盒開發成功并申請了專利[33-38]。試劑盒的國產化和商業化可建立起更低廉的檢測體系，進一步技術的推廣和普及。雖然受到引物設計、假陽性擴增等方面的限制，LAMP在臨床推廣能力上不甚樂觀，但仍具有廣闊的應用前景。在現今研究的基礎上，各領域可以聯合其他技術方法對LAMP擴增過程進行優化，同時針對特異性擴增產物建立起更加有效的檢測方法。未來，LAMP將有望成為常規的基因擴增方法，并逐步推廣到臨床。