煤塵誘導巨噬細胞釋放細胞因子和氧化損傷水平研究

周 勇，張紅梅，何軍山，劉 瑜

（1.湘南學院公共衛生學院，湖南 郴州 423000；2.郴州市疾病預防控制中心，湖南 郴州 423000）

塵肺是全球分布最廣的職業病，是指因吸入生產性粉塵所致的肺泡功能損傷為主的慢性進行性疾病，潛伏期短者幾年，長者可超過20年，病情進展不可逆轉，即使脫離粉塵作業仍可繼續發生發展，其早期表現為巨噬細胞肺泡炎，晚期導致不同程度的肺纖維化。塵肺病是我國發病人數最多，危害最嚴重的一種職業病，每年新發病例占各類職業病總數的80%以上[1]，對塵肺病的預防與控制是公共衛生領域一個重要的研究方向。由于塵肺的纖維化病理改變是不可逆性的，而且目前缺乏有效的治療手段，研究生產性粉塵導致的肺泡巨噬細胞炎性反應及其與接塵工人健康損害的關系，對于塵肺的發生機制的闡明、早期診斷、預防及治療具有重要的意義。

煤工塵肺一直是主要的職業病[2-3]，大批正處于勞動力旺盛時期的勞動者由于患病而基本喪失勞動能力，不得不提前結束職業生涯。因此，我們開展本次研究，為尋找生產性粉塵對健康危害的早期生物標志物提供基礎數據，以期為更好的預防塵肺提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 生產性粉塵的采集 煤塵采自于某涉塵企業作業工作點。通過多級顆粒物采樣器選擇粒徑小于5 μm的粉塵（呼吸性粉塵）染毒巨噬細胞，將染毒的巨噬細胞作為實驗組，細胞空白組作為對照組。

1.2 主要試劑 RPMI 1640細胞培養液（Gibco）、胎牛血清（Sigma）、佛波酯（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、細胞活力的檢測試劑盒（MTT法）、IL-lβ、IL-6、TNF-α等細胞因子ELISA試劑盒（酶聯科技）。

1.3 細胞培養、染毒與測定 選擇THP-1單核細胞進行培養，并通過佛波酯（PMA）刺激THP-1細胞誘導其分化為人肺泡巨噬細胞。實驗細胞隨機分為4組，染毒劑量參考相關研究[4]，分別為：對照組，2 000 μg/ml組（高劑量組），1 000 μg/ml組（中劑量組）和500 μg/ml組（低劑量組），每組10個樣本，染毒8 h。ELISA法分別測定IL-lβ、IL-6、TNF-α等細胞因子水平。操作按試劑盒說明書進行。粉塵中游離二氧化硅含量的測定采用焦磷酸質量法。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計分析表示各指標平均位置和離散程度。樣本均數之間的比較使用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 巨噬細胞活力的檢測結果 染毒8 h后，不同濃度的煤工粉塵均導致巨噬細胞活力下降，隨著粉塵濃度的升高，細胞活力下降越為明顯，組與組之間的細胞活力比較差異有統計學意義（P＜0.05），提示具有一定劑量反應關系，見表1。

表1 煤工粉塵染毒8 h對巨噬細胞活力的檢測結果（Table1 Result of the vitality of macrophages by coal dust exposure

表1 煤工粉塵染毒8 h對巨噬細胞活力的檢測結果（Table1 Result of the vitality of macrophages by coal dust exposure

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2.2 巨噬細胞釋放IL-lβ的檢測結果 與對照組比較，不同濃度的粉塵在染毒8 h后，誘導巨噬細胞釋放IL-lβ的呈升高趨勢，高劑量組釋放的IL-lβ水平最高（867.90 pg/ml），不同劑量組之間的IL-lβ水平比較差異有統計學意義，見表2。

表2 煤工粉塵染毒8h誘導巨噬細胞釋放IL-lβ的檢測結果Table2 Result of IL-lβ release from macrophages induced by coal dust exposure

表2 煤工粉塵染毒8h誘導巨噬細胞釋放IL-lβ的檢測結果Table2 Result of IL-lβ release from macrophages induced by coal dust exposure

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2.3 巨噬細胞釋放IL-6的檢測結果 實驗組的IL-6水平均較對照組高（P＜0.05），且隨著染毒劑量的增高，IL-6的釋放量逐漸增多，呈現明顯的劑量反應關系，見表3。

2.4 巨噬細胞釋放TNF-a的檢測結果 煤工粉塵作用于巨噬細胞后誘導其釋放出TNF-a的水平升高，并隨著粉塵濃度的增加而逐漸上升，低中高劑量組分別為66.71、149.96和249.86 pg/ml，呈現明顯的劑量反應關系，見表4。

表3 煤工粉塵染毒8 h誘導巨噬細胞釋放IL-6的檢測結果（Table3 Result of IL-6 release from macrophages induced by coal dust exposure

表3 煤工粉塵染毒8 h誘導巨噬細胞釋放IL-6的檢測結果（Table3 Result of IL-6 release from macrophages induced by coal dust exposure

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表4 煤工粉塵染毒8h誘導巨噬細胞釋放TNF-α的檢測結果Table4 Result of TNF-α release from macrophages induced by coal dust exposure

表4 煤工粉塵染毒8h誘導巨噬細胞釋放TNF-α的檢測結果Table4 Result of TNF-α release from macrophages induced by coal dust exposure

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3 討論

生產性粉塵中以可呼吸性粉塵（粒徑＜5 μm）對健康損害作用最強，經呼吸道進入肺泡后，通過激活肺泡巨噬細胞聚集、吞噬粉塵，啟動氧化應激、細胞凋亡、炎性反應，最后發展為纖維化。隨著細胞分子生物學和免疫學研究的發展，發現游離二氧化硅粉塵導致的氧化活性和免疫炎性反應是造成機體損傷的關鍵因素[5]，其表面的自由基作用于巨噬細胞，啟動細胞膜的脂質過氧化反應，導致細胞膜流動性降低、通透性增高，細胞受損，進而細胞死亡、破裂。肺泡巨噬細胞受損后，可釋放多種細胞因子[6]，這些因子參與炎性反應及纖維化過程的調控，促進組織修復，但過度的炎性反應可直接或間接損傷肺組織，最終導致纖維化的發生。

生產性粉塵誘導巨噬細胞產生的細胞因子因子類型眾多[7]，有研究顯示，人巨噬細胞在分別被陶瓷廠、鎢礦和錫礦的粉塵染毒后，將會釋放不同水平的IL-lβ、IL-6、TNF-α等細胞因子，并且釋放水平和不同類型粉塵的游離二氧化硅含量以及化學成分有關[8]。本次研究選擇的是粒徑＜5 μm的煤塵對巨噬細胞染毒，也以IL-lβ、IL-6、TNF-α作為綜合反映肺泡巨噬細受損后的指標，通過細胞毒性實驗，觀察煤塵誘導巨噬細胞釋放細胞因子和氧化損傷水平。

結果顯示，煤塵對巨噬細胞染毒后，巨噬細胞產生的IL-6、TNF-α等炎性細胞因子水平升高，均明顯高于對照組（P＜0.05）。且隨著染毒劑量的加大，細胞因子水平的改變越為明顯，2 000 μg/ml組（高劑量組）產生的各種細胞因子水平最高，呈現較為明顯的劑量反應關系（P＜0.05）。有研究表明，在眾多的細胞因子中，IL-6和TNF-α具有明顯的致纖維化作用[9]，說明在游離性二氧化硅引發煤工塵肺纖維化的反應中，IL-6、TNF-α是起著關鍵性作用。

也有研究指出，TNF-α和IL-6兩種細胞因子并不是由生產性粉塵直接作用于巨噬細胞產生的，而是石英誘導巨噬細胞產生IL-1β后，由IL-1β引發的后續炎性反應[10]。阻斷IL-1β可明顯減弱纖維化反應，IL-1β可能是石英誘發的炎性反應向纖維化轉化的中心環節[11]。本次的研究結果顯示，IL-lβ的水平與IL-6、TNF-α的變化趨勢一致，隨著染毒劑量的增高而增高，也存在劑量反應關系。但幾種細胞因子之間的關系，以及在煤工塵肺發病機制中的作用進一步定位，還有煤塵游離二氧化硅含量和化學成分對于巨噬細胞的影響是否和其他類型的粉塵存在不同，有待深入研究。

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