壞死性小腸結腸炎晚發(fā)和長病程動物模型的建立

王玲玲，金 芳，溫博賢，冼 其，熊 慧，林楚琴，黃堃瑩，江觀銀，黃 艷

（1.中山大學附屬第六醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510655；2.廣州市紅十字會醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510220）

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是早產兒致死、致殘的重要疾病，發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床缺乏確切有效的防治手段[1]。動物模型是研究人類疾病的基礎平臺，適宜的動物模型對NEC相關研究具有重要意義[2-3]。

目前公認的NEC模型是采用早產新生鼠，給予高滲配方奶人工喂養(yǎng)和缺氧、寒冷（或細菌內毒素LPS）刺激[Formula Feeding and Cold（or LPS）Asphyxia Stress，F(xiàn)FCAS（FFLAS）]進行誘導[2-4]，存活時間短（平均33.6～45 h[5]），不符合人類NEC“越早產越晚發(fā)”[6]的臨床特點和長時間療效觀察的實驗要求。建立晚發(fā)和長病程動物模型，是NEC研究的迫切需要。

最新研究發(fā)現(xiàn)，NEC“越早產越晚發(fā)”與潘氏細胞損傷有關[8,20]。本研究采用雙硫腙（Dithizone，Dith）選擇性破壞潘氏細胞，結合FFLAS（Dith/FFLAS法），對10日齡SD大鼠進行誘導，成功建立晚發(fā)和長病程NEC模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 10日齡SD大鼠，雌雄不拘，購自中山大學實驗動物中心，隨機分成4組：正常對照組（Control，n=32）采用母鼠喂養(yǎng)；雙硫腙對照組（Dith，n=32）采用注射雙硫腙+母鼠喂養(yǎng)；傳統(tǒng)誘導組（FFLAS，n=32）；新法建模組（Dith/FFLAS，n=47）。

1.2 晚發(fā)NEC誘導 各組乳鼠均置保育箱（T 30～31℃，H 45%～55%）。Dith組和Dith/FFLAS組腹腔注射雙硫腙（Sigma-Aldrich）75 mg/kg體質量[8]，Control組和FFLAS組注射等量溶媒。注射后4 h，Control組和Dith組回歸母鼠喂養(yǎng)；FFLAS組和Dith/FFLAS組持續(xù)置保育箱，給予FFLAS刺激，具體方法參照文獻[3]適當調整：插胃管注入高滲配方奶，1次/4 h，每次40 μl/g體質量；從第1次喂養(yǎng)開始，每12 h給予LPS（055：B5，Sigma）5 mg/（kg·次），加入配方奶中灌胃，之后置缺氧艙（容積1.4 L），予含氧5%的氮氧混合氣體10 L/min通氣10 min。

1.3 NEC長病程誘導 FFLAS組和Dith/FFLAS組持續(xù)給予FFLAS刺激，第7天（7 d）撤除LAS，并將FF由插胃管定量喂養(yǎng)改為奶嘴自主吸吮喂養(yǎng)，每次以半小時內拒絕3次為止。

1.4 實驗終點和采樣時間點 ①FFLAS組和Dith/FFLAS組于17日齡（7 d）脫離保育箱，添加面包、橙子和常規(guī)鼠飼料；所有組別均于21日齡離乳自主覓食，25日齡（15 d）結束實驗。②采樣時間點和樣本預處理：于24 h、72 h、7 d三個時點每組隨機抽取8只，以及實驗終點（15 d）時所有存活鼠（Dith/FFLAS組7 d實際抽取7只，15 d為6只，其它時點及另3組各時點均為8只），麻醉處死，采集末段回腸2 cm，固定、包埋、切片。非抽樣死亡（包括垂死者）亦及時解剖采樣。

1.5 NEC組織學測評 腸組織切片HE染色，單人單盲光鏡下觀察，根據Jilling[4]標準進行評分，0：腸絨毛結構完整；1：絨毛頂端細胞脫落；2：絨毛中部結構破壞；3：絨毛完全破壞，但隱窩結構尚完整；4：隱窩破壞或透壁壞死；≥2分診斷NEC。計算各時點NEC患病率；各組損傷整體情況用（均值±標準差）表示。

1.6 潘氏細胞觀察 腸組織切片AB/PAS染色標記潘氏細胞[8]，光鏡下觀察，隱窩基部含紫紅色顆粒的錐形細胞為潘氏細胞。隨機觀察100個結構完整的隱窩，計數潘氏細胞陽性隱窩數，以此定量表示潘氏細胞發(fā)育水平。

2 結果

2.1 臨床表現(xiàn) Dith/FFLAS組48～72 h普遍出現(xiàn)腹脹、腹瀉，個別出現(xiàn)血便，72 h以后肉眼血便消失，但體質量仍進行性下降（見圖1），撤離LAS后緩慢回升，第12天時與實驗初始體質量比較差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.77，P＞0.05）。FFLAS組體質量增長緩慢，72 h內出現(xiàn)一過性大便松軟，個別有輕度腹瀉，但無腹脹、血便情況。Control組和Dith組無異常。

圖1 時間-體質量變化百分率點線圖Figure1 Plotting of weight change percentage with time-point

2.2 腸組織損傷情況和NEC患病率分析回腸典型組織學特點：Control組各時點回腸黏膜結構完整，絨毛長且排列緊密；Dith/FFLAS組24 h腸絨毛頂端上皮脫落，72 h和7 d腸黏膜充血水腫，絨毛脫落，15 d絨毛稀疏、矮短，結構紊亂。4組腸組織學評分見圖2，差異均有統(tǒng)計學意義（F24h=3.00，F(xiàn)72h=17.05，F(xiàn)7d=14.09，F(xiàn)15d=4.08，P值均＜0.05）。各時點均以Dith/FFLAS組評分最高，不僅與Control組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在72 h、7 d、15 d時點都顯著高于FFLAS組和Dith組（P值均＜0.05，見圖2）。而且，Dith/FFLAS組不同時點病變程度差異有統(tǒng)計學意義（F=6.60，P＜0.01）；72 h和7d損傷程度顯著高于24 h（q72h-24h=5.23，q7d-24h=3.66；P值均＜0.05）和15 d（q72h-15d=4.84，q7d-15d=3.41；P值均＜0.05）。

Control組、Dith組腸組織病理均未達到NEC診斷標準。Dith/FFLAS組24 h、72 h、7 d、15 d時點NEC患病率分別為1/8、7/8、5/7、1/6，F(xiàn)FLAS組則為0/8、2/8、1/8、0/8，兩組患病高峰均在72 h～7 d，Dith/FFLAS組顯著高于FFLAS組（P72h=0.019；P7d=0.034），Dith/FFLAS組72 h與7 d患病率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.369），但顯著高于24 h（P72h-24h=0.005；P7d-24h=0.034）和15 d（P72h-15d=0.016）。

圖2 4組各時點回腸組織學評分Figure2 Histological scores of four groups at each time point

2.3 生存分析 截至實驗終點，Control、Dith、FFLPS3組均無非抽樣死亡。Dith/FFLPS組生存分析如圖3，3 d存活率76.22%，7 d 58.07%，15 d（已成功離乳獨立生存）38.72%。死亡高峰發(fā)生在誘導開始的第1個24 h（5只），脫離保育箱的第1個24 h死亡3只，之后未再發(fā)生死亡；24 h～7 d之間死亡的10只，有6只發(fā)生在缺氧期間。

死亡的18只乳鼠腸組織損傷情況見圖4：第1個24 h NEC患病率不高（1/5），之后死亡者幾乎都有不同程度的NEC樣病變。

圖3 生存分析Figure3 Diagram of survival analysis

圖4 Dith/FFLPS組非抽樣死亡乳鼠回腸組織學評分Figure4 Histological scores of pups died without sampling of group Dith/FFLPS

2.4 潘氏細胞發(fā)育情況Control組隨著日齡的增長回腸潘氏細胞數量增加，AB/PAS染色增強；Dith/FFLPS組潘氏細胞發(fā)育緩慢，不僅細胞顆粒少、著色淺，而且陽性隱窩數量少。

各時點潘氏細胞發(fā)育水平見圖5。4組差異均有統(tǒng)計學意義（F24h=7.71，F(xiàn)72h=6.79，F(xiàn)7d=13.41，F(xiàn)15d=16.03，P均＜0.001）。Dith組和Dith/FFLPS組24 h潘氏細胞數量顯著減少，Dith組72 h恢復（與Control相比，q=0.98，P＞0.05）并保持正常發(fā)育；Dith/FFLPS組潘氏細胞發(fā)育緩慢，直至15 d仍顯著低于Control組（P＜0.05）；FFLAS組發(fā)育逐漸落后，至7 d和15 d與Control組比較差異有統(tǒng)計學意義（q7d=4.18，q15d=4.56；P＜0.05），但一直高于Dith/FFLPS組（P＜0.05）。

圖5 4組各時點回腸組織潘氏細胞陽性隱窩數Figure5 Percentage of ileal crypts with Paneth cells at each time point

3 討論

NEC沒有自發(fā)動物模型，主要是模擬致病危險因素進行誘導[2]。目前唯一公認和成熟的NEC模型是采用早產鼠，給予高滲配方奶人工喂養(yǎng)，結合缺氧和寒冷刺激（FFCAS）進行誘導。該方法最初由Barlow等在1974年創(chuàng)立，后經多位學者改良，并將實驗對象擴展到自然分娩的新生鼠（強調未進食母乳）[9]，方法上省去寒冷刺激，添加細菌內毒素灌胃（FFLAS）[3]。這些對FFCAS法的合理簡化，已被廣泛采用[10-12]。

FFCAS（FFLAS）法建立的新生鼠NEC模型，為NEC相關研究做出了重要貢獻，但存在兩個問題：①與人類NEC“越早產越晚發(fā)”的特點缺乏相似性。多中心隊列研究顯示[6]：NEC不僅“越早產越高發(fā)”，而且“越早產越晚發(fā)”。新生鼠不僅腸道菌群尚未建立，而且消化道成熟度遠低于人類[2，7]，用于發(fā)病機制研究時，在某些方面可能會“失真”。②不能進行長時間觀察，在治療研究方面缺乏適用性。新生鼠FFCAS法誘導24 h后開始陸續(xù)發(fā)病[4]，72～96 h成模率52.7%～85%[13-15]，平均存活時間33.6～45 h[5，16]。為了有足夠的觀察期，目前的治療學研究都是給藥與造模同時進行，本質上屬于預防性干預。成模后干預的報道只有一篇，僅觀察了4 d[17]。因此，建立晚發(fā)和長病程動物模型，是NEC研究的迫切需要。

如果新生鼠出生一段時間后再誘導建模，不僅能滿足“晚發(fā)”的要求，而且對疾病的耐受能力增強，或可帶病存活較長時間從而建立長病程模型。但是，由于母乳的保護作用，以及隨著日齡的增長腸黏膜自穩(wěn)能力日趨成熟，F(xiàn)FCAS（FFLAS）法能否誘導成功是個問題。研究發(fā)現(xiàn)，母鼠喂養(yǎng)12～24 h的新生小鼠，NEC發(fā)病率明顯低于母鼠喂養(yǎng)不足12 h者（44%vs 70%，P＜0.05）[5]；小鼠出生14 d后FFCAS法就不能誘導出NEC[2]。

FFLAS法在新生大鼠的72～96 h成模率為50%～75%[3]，尚未見用于較大日齡大鼠。本項目結果顯示，10日齡SD大鼠在FFLAS誘導下體質量增長緩慢，臨床無典型NEC癥狀；72 h成模率（2/8）。結合雙硫腙進行誘導（Dith/FFLAS法），則普遍出現(xiàn)NEC臨床癥狀，72 h成模率87.5%（7/8），兩者的成模率和損傷程度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可見，隨著乳鼠日齡的增加，F(xiàn)FLAS不再適宜的建模方法，Dith/FFLAS能有效建立晚發(fā)NEC模型。

Dith是重金屬螯合劑，能選擇性破壞潘氏細胞（富含鋅）。新生鼠潘氏細胞尚未發(fā)育，隨著日齡的增加逐漸成熟。Zhang等[8]采用14～16日齡小鼠，腹腔注射Dith，繼之克雷伯桿菌灌胃（Dith/Kleb），16 h NEC成模率76.67%；單純Dith注射或細菌灌胃都不能誘導NEC樣病變。類似的方法在5日齡小鼠[8]和4日齡大鼠[19]都不能誘導NEC。這些研究提示：NEC發(fā)生在潘氏細胞相對成熟之后[8，20]。

潘氏細胞是腸黏膜最重要的天然免疫細胞，它不僅產生豐富的抗菌肽（AMP），而且產生多種促炎因子（TNF-a、IL-1β、IL-17等）[7，20]。

人類早產兒潘氏細胞的數量和功能遠低于足月兒。NEC“越早產越高發(fā)”和“越早產越晚發(fā)”，這一臨床現(xiàn)象提示：NEC患兒腸黏膜免疫功能不成熟，但又要有一定的成熟度，“過度炎癥反應”才可能發(fā)生[7]。結合上述動物實驗研究，有學者推測：早產兒生后需要一段時間，待潘氏細胞發(fā)育至一定的成熟度，有足夠的促炎因子和反應能力的情況下，才能啟動NEC[7，20]。

基于上述認識，2013年McElroy等[20]提出了NEC源自潘氏細胞損傷的“自底而上”假說（‘bottom up’hypothesis）：微生物或其毒素入侵腸隱窩，破壞潘氏細胞；受損的潘氏細胞從基底側向黏膜固有層及微血管釋放TNF-a、IL-1β、IL-17等促炎因引發(fā)炎癥反應和血管內皮損傷、血栓形成，導致腸黏膜凝固性壞死。

本文注射Dith的兩組乳鼠24 h潘氏細胞數量均顯著減少，但Dith/FFLAS組24 h成模率很低，72 h和7 d成模率和病損嚴重程度最高；對死亡乳鼠的病理分析與這一趨勢吻合。Dith組和FFLAS組均無死亡，Dith組無NEC樣病變，F(xiàn)FLAS組各時點患病率和病損程度均顯著低于Dith/FFLAS組，說明Dith/FFLAS組死亡和成模都不是Dith或FFLAS單一作用的結果，而是兩者的協(xié)同效應。

但死亡峰先于成模峰，死亡峰在24 h內，這一時間段不論死亡還是抽樣的乳鼠NEC患病率都非常低（圖2、圖3）。這一現(xiàn)象與上述Dith/Kleb法16 h成模的實驗結果不同，不支持“自底而上”假說，但也不能否定這一假說，因為LPS不能模擬活菌的生物學行為，而且受試對象（大鼠vs小鼠）和發(fā)育水平（日齡）也不同。

對于Dith/FFLAS法能在10日齡SD大鼠成功誘導NEC，以及死亡峰先于成模峰的原因，我們推測：①Dith對潘氏細胞的破壞削弱了腸屏障功能，使得更多的LPS進入血循環(huán)，加重毒血癥程度；②Dith使金屬酶功能障礙，削弱了機體對毒血癥和缺氧的耐受能力；③金屬酶功能和腸屏障功能障礙增加了機體的NEC易感性。

目前尚未見對NEC“長病程”模型進行系統(tǒng)研究的報道。Zani等[11]在進行干細胞治療NEC的實驗研究時，為了有足夠的療效觀察期，對FFLAS法作了調整：給予新生大鼠FFLAS刺激，48 h撤除LPS，96 h停止缺氧刺激，單純給予高滲配方奶人工喂養(yǎng)（FF），第7天存活率不足20%，沒有NEC患病率的描述。提前撤除誘導因素可能降低患病率，以此為代價謀求延長療效觀察時間，反映了傳統(tǒng)NEC模型的局限性。

本項目Dith/FFLAS法誘導第7天NEC患病率71.43%（5/7），第15天病變仍未完全修復（圖2），平均存活時間6.25天，說明本項目成功建立了長病程NEC模型。

本文Dith組體質量正常增長，72 h潘氏細胞數量恢復正常，提示此時Dith對機體的直接影響已經消失。而且，F(xiàn)FLAS組7 d組織學評分與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義（見圖2）。說明長病程NEC不是Dith或FFLAS直接所致，而是在Dith/FFLAS誘導成模后的病變遷延，是FFLAS阻礙腸黏膜修復的結果。

腸黏膜修復的主體是腸上皮干細胞（Intestinal Sterm Cell，ISC），與潘氏細胞緊密相鄰；潘氏細胞是其“衛(wèi)士”和“龕細胞”，對維持腸上皮穩(wěn)態(tài)有重要意義[21]。本文不僅Dith/FFLAS組潘氏細胞恢復緩慢，而且FFLAS組潘氏細胞發(fā)育也明顯落后，這與Estienne等[22]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)早期母愛剝奪使乳鼠潘氏細胞數量減少，功能發(fā)育遲滯。而且，細菌內毒素LPS抑制腸上皮修復[18]。LPS是TLR4的配體。最新研究發(fā)現(xiàn)：ISC表達TLR4，激活TLR4誘導ISC凋亡，導致未成熟小鼠NEC易感性增加和腸黏膜修復能力下降[23]。

因此，Dith/FFLAS法建立NEC長病程模型的機制可能是：Dith破壞潘氏細胞，人工喂養(yǎng)造成的母愛剝奪使之發(fā)育延遲，直接影響ISC生存的微環(huán)境，而且削弱了腸黏膜免疫屏障，使得腸腔微生物成分（如LPS）更易接觸到ISC，與其表面的TLR4結合，激活ISC凋亡程序，從而削弱腸黏膜修復能力，使NEC病變遷延。撤除LPS后體質量增長也支持這一推斷。

綜上所述，本文結果說明：①傳統(tǒng)的FFLAS法在10日齡大鼠的成模率低，不適合作為晚發(fā)NEC的建模方法；②Dith/FFLAS能成功建立晚發(fā)NEC模型，成模高峰為72 h，成模率87.50%；③在晚發(fā)NEC的基礎上繼續(xù)給予FFLAS刺激，能成功誘導NEC長病程模型，病變至少遷延至第7天，第15天仍未完全修復；④38.72%的模型鼠能成功離乳獨立生存，觀察期可任意延長。

本文首次對NEC長病程模型進行了初步系統(tǒng)的探索，率先用Dith/FFLAS法建立晚發(fā)和長病程模型，為NEC相關研究提供新平臺。本模型尤其適合治療學研究。

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