金匱腎氣丸對12月齡雄性小鼠脾組織代謝組 學增齡改變的影響

梁華，劉麗瑋，馬艷春，王燕，隋雨桐，李奇偉，閆起

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

代謝組學自20世紀90年代提出開始，近三十年得到了廣泛的研究與應用，其作為一門新興的組學學科，與基因組學、蛋白質組學、轉錄組學等一起成為系統生物學的重要組成部分。代謝組學運用精準的儀器和數據通過對機體代謝物的計量分析，找到代謝物與機體病理生理變化之間的聯系，對相關疾病的探索研究提供科學的理論支持[1]。以小見大，從局部分析整體，與中醫基礎理論不謀而合，代謝組學有效地將中醫與現代科學手段相結合，為中醫藥現代研究奠定了堅實的基礎。

金匱腎氣丸是治療腎陽虛證的經典方劑，由附子、肉桂、熟地黃、山藥、澤瀉等組成。大量實驗研究表明，金匱腎氣丸可使血液中的SOD升高，MDA降低，明顯改善腎虛癥狀[2]，抑制自由基生成并降低MDA水平，顯著降低細胞凋亡率，這些作用被認為是金匱腎氣丸抗衰老作用的重要的機制[3]。補腎中藥通過多種靶點的綜合作用，對抗衰老發揮作用，因此補腎與抗衰老之間存在密切聯系[4]。朱明雪等[5]人對金匱腎氣丸的免疫調節作用進行了系統的歸納總結，發現金匱腎氣丸對老齡機體、陽虛機體和荷瘤機體有重要的免疫調節作用，為研究抗衰老與免疫學機制之間的作用關系提供了理論基礎。另有研究表明，金匱腎氣丸可有效改善老年前列腺增生患者的臨床癥狀，提高患者的生活質量，對老年性疾病的研究和治療具有重要意義[6]。

本實驗運用代謝組學技術，對金匱腎氣丸干預下的增齡小鼠的脾組織代謝物質的變化進行分析，探索與增齡密切相關的生物標志物及代謝通路，以及金匱腎氣丸的調節作用，為今后研究金匱腎氣丸干預生長發育相關的生物學基礎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國Waters公司ACQUITY UPLCTM液相色譜儀，美國Waters公司Waters LCT Premier XETOF 質譜儀，KDC-160HR高速冷凍離心機(中國科大創新股份有限公司中佳分公司)，MassLynx V4.1工作站，Progenesis QI 2.1軟件，P80MX超速冷凍離心機，超純水純化系統，-80℃冰箱。

1.2 藥品與試劑

金匱腎氣丸湯劑(黑龍江中醫藥大學國醫堂)；生理鹽水(哈爾濱三聯藥業有限公司)；屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；色譜甲醇(美國賽默飛世爾公司)；色譜乙腈(美國賽默飛世爾公司)；甲酸(北京迪馬科技歐泰科技發展中心)。

1.3 動物

SPF級ICR雄性小鼠，3月齡10只，12月齡20只，由遼寧長生生物技術有限公司提供(許可證號：SCXK(遼)2010-0001)。實驗室飼養溫度(22±2)℃，濕度55%±15%，空氣新鮮，12 h避光，12 h光照，自由飲食飲水，喂食固體飼料(購自哈爾濱市南崗區玉英養殖場)。

1.4 藥品的制備

金匱腎氣丸配方：干地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，桂枝3 g，附子3 g，共81 g。加水煎煮兩次，每次1 h，合并藥液，制成生藥濃度為0.81 g/mL的藥液。

1.5 樣品采集與制備

3月齡小鼠10只為空白對照組，12月齡小鼠20只隨機分為模型組和金匱腎氣丸組各10只，并分別標記。金匱腎氣丸組給藥量為13 mL/(kg·d)，空白組和模型組對照同體積比生理鹽水。每天上午8:30—9:30之間給藥，共計30 d。小鼠在第30天禁食，不禁水，次日處死小鼠，取脾組織，測重標記后液氮凍存，后存入-80℃冰箱備用。采用甲醇有機溶劑沉淀蛋白法，在脾組織中加入10倍甲醇勻漿(冰浴條件下)，勻漿液在12 000×g，4℃條件下離心15 min，取上清液重復以上離心，最后取200 μL供UPLC-TOP/MS分析。

1.6 分析條件

1.6.1 超高液相色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；樣品倉溫4℃；流動相A：0.1%甲酸—乙腈溶液；流動相B：0.1%甲酸—超純水溶液；梯度洗脫條件：0 min，2%A，98%B；15 min，100%A，0%B。

1.6.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)：毛細管電壓正離子模式下1 300 V；負離子1 500 V；正離子樣本錐孔電壓60 V；負離子70 V；脫溶劑溫度350℃；離子源溫度110℃；脫溶劑氣體流速750 L/h；錐孔氣體流速20 L/h；碰撞能60 V；采用美國Waters公司Lockspray校正系統進行在線質量校正，正離子模式下校正液為亮氨酸—腦啡肽(Leucine—Enkephalin，[M+N]+556.2771)溶液，負離子模式下校正液為亮氨酸—腦啡肽(Leucine—Enkephalin，[M+N]-554.2615)溶液；濃度為1 ng/mL，流速20 μL/min；校正頻率為15 s；全掃描方式，質量掃描范圍:m/z100—1 500。

1.6.3 數據處理

本實驗運用Progenesis QI 2.1軟件進行色譜峰識別及峰匹配，采用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析法(OPLS-DA)分析青年對照組與12月模型組的代謝差異物，選取潛在生物標志物。

2 結果

利用代謝組學研究技術，對實驗結果進行數據分析，從三組樣本的PCA得分圖(圖1、圖2)可見：正負離子條件下，3月對照組，12月模型組和金匱組所有樣本有明顯區分，而金匱組于Y軸上位于3月對照組與12月模型組之間，并更接近于3月對照組。表明三組樣本的內源性代謝物存在顯著差異，而金匱組對于12月模型組有顯著回調作用。對3月對照組和12月模型組小鼠進行OPLS-DA(圖3、圖4)分析，可見在正負離子條件下，3月對照組與12月模型組沿Y軸區分明顯，說明兩組樣品有明顯區分。在S-Plot圖(圖5、圖6)和VIP散點圖(圖7、圖8)中，碎片離子呈S型、V型排列，并且遠端更為分散，說明對代謝軌跡產生較大影響，本實驗對VIP 值大于2且P值小于0.05作為篩選條件，找到對代謝輪廓變化起關鍵性作用的內源性生物標記物。采用 UPLC-HDMS 的方法檢測標記物，利用HMDB及KEGG等數據庫檢索并結合Progenesis QI 2.1軟件進行化合物鑒定，確定出與增齡相關的潛在生物標記物26個(圖9-1、9-2)，如表1所示，其中11個代謝差異物表現為不同程度的上調(2-Octenoic acid、Xanthine、Lactosylceramide (d18:1/12:0)、Taurine、Pyruvic acid、Threonic acid、6,8-Dihydroxypurine、Lipoxin A4、Monoethylhexyl phthalic acid、Canrenone、Isodeoxycholic acid)，15個代謝差異物表現為不同程度的下調(Stearoylcarnitine、Glycocholic acid、9-Hexadecenoylcholine、N-Acetylserine、Uric acid、Pyroglutamic acid、17-alpha,20-alpha-Dihydroxypregn-4-en-3-one、Taurodeoxycholic acid、Homoanserine、20-Hydroxyeicosatetraenoic acid、Varanic acid、Dodecanoylcarnitine、Phosphoribosyl-ATP、Docosahexaenoic acid、Arachidonic acid)。如圖9所示，在確定的26個標記物中，金匱組對其中的9個具有調節作用，分別是Taurodeoxycholic acid、Glycocholic acid、Xanthine、9-Hexadecenoylcholine、Lactosylceramide (d18:1/12:0)、Threonic acid、Homoanserine、6,8-Dihydroxypurine、Monoethylhexyl phthalic acid。將鑒定得到的與增齡相關的26個標記物輸入METPA數據庫中，得到以下代謝通路(圖10)，將臨界值設定為0.10，主要得到以下代謝通路：a牛磺酸和牛磺酸代謝(Taurine and hypotaurine metabolism)、b花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)、c、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)。以上結果說明金匱腎氣丸對增齡性相關生物標記物及代謝通路有一定的調節作用。

圖1 正離子條件下3月對照組、12月模型組、 金匱組PCA分析后Scores plot圖

圖2 負離子條件下3月對照組、12月模型組、 金匱組PCA分析后Scores plot圖

圖3 正離子條件下3月對照組、12月模型組OPLS—DA圖

圖4 負離子條件下3月對照組、12月模型組OPLS—DA圖

圖5 正離子條件下12月模型組S-Plot圖

圖6 負離子條件下12月模型組S-Plot圖

圖7 正離子條件下12月模型組VIP散點圖

圖8 負離子條件下12月模型組VIP散點圖

注：↑表示與空白組相比，模型組表達水平呈上升趨勢；↓表示與空白組相比，模型組表達水平呈下降趨勢

3 討論

本實驗采用自然增齡小鼠模型，利用代謝組學研究方法分析金匱腎氣丸對12月齡雄性小鼠的內源性代謝差異物的調節作用，初步判定9個生物標記物：Taurodeoxycholic acid、Glycocholic acid、Xanthine、9-Hexadecenoylcholine、Lactosylceramide (d18:1/12:0)、Threonic acid、Homoanserine、6,8-Dihydroxypurine、Monoethylhexyl phthalic acid。

圖9-1 生物標記物在3月空白組、12月模型組、 金匱組中的水平表達注：與空白組比較，*P<0.05；**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05；##P<0.01

牛磺去氧膽酸(Taurodeoxycholic acid)是肝臟中的膽鹽，由脫氧膽酸與牛磺酸結合而成，能夠促進肝臟的排泄和吸收，并能夠調節內分泌。牛磺酸作為機體組織細胞中一種重要的小分子含硫氨基酸，具有廣泛的生理調節作用。大量實驗證明牛磺酸具有增強免疫、抗氧化抗衰老、保護心血管、降血糖血脂、減輕脂肪肝、降轉氨酶等諸多作用[7]。有研究證實，牛磺酸能夠有效減少高糖環境下線粒體呼吸鏈中活性氧ROS生成，降低ROS活性，從而提高機體抗氧化能力[8]。牛磺酸對老年雄性大鼠的實驗研究表明，其作用機制是增強機體清除氧自由基的能力，從而達到抗氧化目的，維持細胞內環境的穩定，從而起到保護細胞，延緩衰老的作用[9]。同時，牛磺酸對降低心肌梗死面積，改善心肌細胞，促進血管新陳代謝，保護心臟起到重要作用[10]。本實驗模型組牛磺酸含量較空白組顯著降低，表明牛磺酸隨增齡而減少，而在金匱腎氣丸給藥后，含量有所上升。

甘氨膽酸(Glycocholic acid)是膽汁酸酰基甘氨酸，膽汁酸是膽固醇在肝內分解以及在腸-肝循環中的一組代謝產物，膽酸在肝內與甘氨酸結合生成甘氨膽酸，然后隨膽汁排入腸道，膽汁酸是一種生理性的清潔劑，能促進脂肪和固醇在腸道和肝臟中的排泄、吸收和運輸。有研究表明，高、低劑量不同的甘氨膽酸均能夠不同程度的提高小鼠血漿、腦組織中T-AOC活性，以及小鼠腦組織中GSH活性，表明甘氨膽酸具有重要抗氧化作用[11]。本實驗中模型組甘氨膽酸較空白組明顯降低，推測機體隨增齡而抗氧化能力減弱，而金匱腎氣丸給藥后，含量上升，說明金匱腎氣丸具有提高抗氧化能力的作用。

黃嘌呤(Xanthine)是嘌呤衍生物，是嘌呤降解途徑的產物。現代研究表明黃嘌呤氧化酶對于炎癥、組織修復以及多種腫瘤的發展有密切關系[12]。有學者研究聯合黃嘌呤氧化酶抑制劑治療慢性心力衰竭，結果顯示患者的心功能指標有改善[13]。本實驗中金匱腎氣丸組能顯著降低模型組黃嘌呤的含量，可以推斷其能夠提高機體免疫力，減少炎癥的發生。

單乙基己基鄰苯二甲酸(Monoethylhexyl phthalic acid,MEHP)是一種活性代謝產物，鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)的主要代謝產物是鄰苯二甲酸單(2-乙基已基)酯(MEHP)，有實驗表明，低劑量的MEHP能刺激MLTC-1細胞睪酮合成，促進相關酶基因和蛋白基因表達[14]。而睪酮作為一種重要的雄性激素，對蛋白質合成，免疫功能，抗骨質疏松等有重要影響。本實驗對金匱腎氣丸組中的含量進行檢測發現較模型組有所回落，表明其能夠促進蛋白合成，提高免疫力。

綜上所述，本實驗采用代謝組學研究方法，鑒定出在增齡過程中與生長發育相關的26個潛在生物標記物，在給予金匱腎氣丸干預后，9個生物標志物得到調節，表明了金匱腎氣丸對12月雄鼠增齡性變化的干預作用，為今后研究金匱腎氣丸干預生長發育及其方證相關的生物學基礎研究提供科學依據。

[1] 黃張杰,施旭光,王閩予,等.代謝組學技術在中醫藥研究中的應用進展[J].中藥材,2013,36(12):2055-2058.

[2] 王新玲,徐希國,張桂.金匱腎氣丸抗衰老作用臨床觀察[J].山東醫藥,2006,46(16):82.

[3] 王新玲,李月彩,侯穎春.金匱腎氣丸抗自由基和細胞凋亡的作用[J].醫學爭鳴,2000,21(10):1209-1211.

[4] Jiang Q,Zheng M,Yang X,et al.Analysis of molecular networks and targets mining of Chinese herbal medicines on anti-aging[J].Bmc Complementary & Alternative Medicine,2016,16(1):520.

[5] 梁華,朱明雪,孫燕佩，等.六味地黃丸、金匱腎氣丸的免疫調節作用研究進展[J].中醫藥學報,2012,40(2):97-99.

[6] 廖茜珣,侯伯南,羅曉光,等.金匱腎氣丸治療老年前列腺增生的臨床效果觀察[J].中藥藥理與臨床,2016(5):96-98.

[7] 李大慶,吳明均,胡曉華,等.牛磺酸研究進展[J].現代生物醫學進展,2011,11(2):390-392.

[8] 高亞,郭俊霞,張艷貞,等.牛磺酸降血糖作用研究進展[J].中國食品學報,2016,16(1):202-210.

[9] 楊建成,馮穎,呂秋鳳,等.牛磺酸對老年雄性大鼠抗衰老作用的研究[J].中國老年學,2007,27(11):1020-1022.

[10] 王亞霓.牛磺酸的心臟保護作用及機制研究[D].天津：天津醫科大學,2014.

[11] 烏云夫.甘氨膽酸對小鼠的抗氧化作用研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學,2013.

[12] 馬文濤.黃嘌呤氧化酶、脂氧化酶和環氧化酶抑制劑的篩選及其體外抗腫瘤活性研究[D].武漢：湖北中醫藥大學,2016.

[13] 徐莉.黃嘌呤氧化酶抑制劑治療慢性心力衰竭的Meta分析[D].重慶：重慶醫科大學,2016.

[14] 周慶紅,張靜姝,陳曦,等.DBP/MBP,DEHP/MEHP影響睪丸間質細胞睪酮合成相關機制[J].中國藥理學與毒理學雜志,2013,27(1):246.