基于Nrf2/HO-1 信號通路探討豨薟草對 尿酸鈉誘導的滑膜細胞作用機制

孫冠男，于雪峰，陳水林,徐軼爾，孫貴才*

(1.道外區人民醫院，黑龍江 哈爾濱 150020;2.南昌大學第四附屬醫院，江西 南昌 330003; 3.哈藥集團藥物研究院，黑龍江 哈爾濱 150025)

豨薟草為常用中草藥，是一年生草本植物豨薟(SiegesbeckiaorientalisL)，腺梗豨薟(S.pubescensMak)或毛梗豨薟(S.glabrescensMak)的全草；又名豨薟、稀薟草、火薟、豬膏莓等。豨薟草味辛、苦、寒，具有祛風濕、利關節和解毒之功效，主要用于治療風濕痹癥，關節疼痛，筋骨無力，腰膝酸軟等[1]。我們前期研究發現以豨薟草為主藥的復方豨薟草膠囊能夠明顯降低痛風性關節炎模型大鼠血清中腫瘤壞死因子水平、明顯降低炎性因子的釋放，降低NF-κB的轉錄，明顯改善痛風性關節癥狀[2-3]。

急性痛風性關節炎發作是尿酸鈉(monosodium urate，MSU)微晶體在關節內及關節周圍組織沉積引起的急性炎癥反應，是出現痛風的臨床癥狀的直接原因[4]。沉積的關節周圍的尿酸鈉微晶體在人體內能夠與中性粒細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞和關節滑膜細胞等發生反應，釋放IL-1、IL-8和TNF-α等炎性因子，炎性因子之間相互作用進一步影響痛風性關節炎的發生發展[5-6]。研究發現最新研究發現氧化應激在急性痛風性關節炎發生發展過程中也扮演著重要的作用[7]。大量氧自由基(ROS)和脂質過氧化物的產生均能夠導致關節的損傷，進而出現劇烈疼痛和功能障礙，丙二醛(MDA)是脂質過氧化產物，含量的變化能過代表脂質過氧化水平和對機體的損傷程度，超氧化物歧化酶(SOD)是一種超氧陰離子和氧自由基清除劑，具有明顯的抗炎癥、抗感染和抑制脂質過氧化作用，在疾病和炎癥的發生和發展中發揮著重要作用[8]。并且臨床研究發現痛風性關節炎患者體內存在SOD含量降低，是多方面因素共同影響的結果，說明SOD的表達失調參與了痛風性關節炎的發病過程[9]。

以往的研究發現尿酸鈉結晶沉積在關節后，能夠激活多種信號通路參與GA炎癥的發生發展，其中抗氧化能力動態失衡也是痛風性關節炎發病因素之一。核轉錄因子E2相關因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)作為重要的轉錄因子[10]，能夠與核內ARE結合，進一步調控抗氧化基因 HO-1)表達，研究發現Nrf2-ARE是調節細胞內抗氧化防御體系的重要信號通路，抵抗氧化應激損傷方面發揮著重要的作用[11-12]。機體內源性抗氧化信號通路最近被發現：Nrf2/HO-1 信號通路具有抵抗內外界氧化和化學物質刺激所產生的氧化應激損傷，使生物體抵抗各種外來損傷中起著非常重要的作用，是生物體內最重要的內源性抗氧化信號通路，是現今氧化應激研究領域的熱點內容[13]。因此，本實驗以Nrf2/HO-1信號通路為基礎，探討痛風性關節炎的發生發展與Nrf2/HO-1信號通路之間的關系及中藥豨薟草干預機制影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試藥與動物

豨薟草購于哈爾濱市同仁堂大藥房；青霉素和鏈霉素、DMEM培養基、胎牛血清和胰酶購于Hyclone公司， 尿酸鈉( Uric acid sodium salt，U2875-5G) 購自美國Sigma 公司；大鼠白細胞介素IL-1、白細胞介素IL-8和腫瘤壞死因子TNF-α酶聯免疫試劑盒購于美國R&D公司；ROS、SOD和MDA試劑盒購于DECO；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；實驗動物由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 滑膜細胞的分離和培養

將SD大鼠脫臼處死，置于75%的乙醇中浸泡15 min，沿膝關節正中縱向切開，剝離肌肉和膝蓋骨，可見平滑光亮的滑膜組織，分離滑膜組織并去除脂肪組織，用含青霉素200 kU/L和鏈霉素200 mg/L的D-Hank’s液漂洗3次，將滑膜組織用眼科剪刀剪碎1 500 r/min,離心10 min，離心洗滌2次，去除上清液，加入100 μL的FBS混勻，將混勻的滑膜組織平鋪培養瓶中，放入培養箱培養15 min，使之自然貼壁，在加入3 mL含20%FBS的DMEM培養液，37℃，5% CO2培養5～7 d，更換培養液繼續培養，傳代培養第三代用于本實驗的研究，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.3 豨薟草提取物及含藥血清制備

將豨薟草藥材40℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80℃提取2次，每次提取30 min。過濾，棄去濾渣，合并濾液，過濾，將溶液濃縮至100 mL，離心2 000 r/min ，10 min，取上清液，將濃度調整為250 mg/mL備用。取24只SD健康大鼠，隨機分為4組，每組6只。依據《藥理實驗方法學》[14]中不同物種間給藥劑量換算公式，大鼠灌胃給予豨薟草低、中、高劑量分別為1 g/kg，2 g/kg，4 g/kg，對照組灌胃給予同體積的生理鹽水;每日分2次，連續給藥14 d。各組均于末次給藥后1 h采集靜脈血漿，室溫靜置2 h，離心，取上清，將同一組的血漿混合后56℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm無菌濾器過濾除菌、分裝，制備高、中、低的劑量豨薟草含藥血清及大鼠空白血清。以上血清均-70 ℃保存備用。

1.4 滑膜細胞中ROS、SOD和MDA測定

將第三代滑膜細胞平鋪于24孔培養板，待細胞融合至80%左右，加入相應濃度的豨薟草。對照組、模型組、豨薟草高劑量組(4 g/kg)、豨薟草中劑量組(2 g/kg)和豨薟草低劑量組(1 g/kg)除對照組外各實驗組中加入尿酸鈉(0.1 mg/mL)繼續培養24 h，培養結束后，棄上清液，按照DECO試劑盒說明書要求對滑膜細胞進行處理，測定滑膜細胞中ROS、SOD和MDA含量。

1.5 實時PCR檢測滑膜細胞中Nrf2、HO-1mRNA表達

將第三代滑膜細胞平鋪于24孔培養板，待細胞融合至80%左右，加入相應濃度豨薟草。對照組、模型組、豨薟草高劑量組(4 g/kg)、豨薟草中劑量組(2 g/kg)和豨薟草低劑量組(1 g/kg)的滑膜細胞，除對照組外各實驗組中加入尿酸鈉(0.1 mg/mL)繼續培養24 h，棄上清液，PBS洗兩次，收集不同組別的滑膜細胞加入Trizol裂解液，提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明將提取的總mRNA逆轉錄成cDNA，并應用cDNA用于實時定量PCR檢測，引物序列有上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：HO-1上游引物：5′-AGCCCCACCAAGTTCAAACA-3′，下游引物：5′-TGCCAACAGGA AGCTGA GAG-3′，Nrf2上游引物:5′-CCATTCCCAGTTACAGTGTCTT-3′, 下游引物:5′-GATCGATGAGTAAAAATGGTA′, β-actin上游引物:5′-GAGACCTTCAACAC CCCAGC-3′,下游引物:5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′。

1.6 統計分析

采用SPSS19.0進行統計學分析，所有數據用χ2表示，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 滑膜細胞形態

滑膜細胞貼壁5～7 d，在光學顯微鏡下觀察，可見組織塊周圍有少量細胞生長，細胞形態不規則，但都以長梭形為主；9～11 d，可見大量細胞生長，以長梭形細胞為主，但仍有少量圓形和多角形的細胞存在；繼續培養至90%細胞融合時，用胰酶消化，傳代繼續培養，傳至第三代可見成纖維細胞樣細胞，呈長梭形均勻分布，見圖1。

圖1 光鏡下滑膜細胞形態注：A表示培養5～7 d的滑膜細胞；B表示培養9～11 d的滑膜細胞；C表示傳至第三代的滑膜細胞

2.2 滑膜細胞中ROS、SOD和MDA含量變化

如表1所示，與對照組比較，尿酸鈉處理滑膜細胞中ROS和MDA含量明顯增加，豨薟草高、中、低組都能夠明顯降低ROS和MDA含量，且豨薟草高、中、低組均可以使SOD含量明顯升高，且呈劑量依賴性，表明豨薟草能夠抑制滑膜細胞發生氧化應激從而起到保護滑膜細胞正常生理功能的作用。

表1 豨薟草對尿酸鈉處理滑膜細胞氧化應激損傷影響

注:與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

2.3 滑膜細胞中Nrf2和HO-1mRNA表達結果

如表2所示，與對照組比較，不同濃度豨薟草處理的滑膜細胞中Nrf2和HO-1 mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，且隨著豨薟草濃度的增加Nrf2和HO-1表達也逐漸增加。

表2 豨薟草對尿酸鈉處理滑膜細胞中Nrf2 和HO-1表達影響

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

3 討論

痛風性關節炎是一種以劇烈疼痛為特點的無菌性炎癥反應，發病率逐年升高，給社會和患者帶來了嚴重的經濟負擔，痛風性關節炎的發病機制十分復雜，關節腔內尿酸鈉析出，觸發機體固有免疫反應，導致關節及周圍組織的急性反應，但具體的發病機制還不清楚。

生理狀態下機體組織內自由基的產生與消除維持在動態平衡，有效的抗氧化防御系統能夠使自由基的濃度控制在一定范圍內，當機體組織過度產生自由基或抗氧化系統功能受損，機體發生氧化應激[15]。氧化應激損傷主要由活性氧物質(ROS)所致，有害的活性氧自由基可通過脂質過氧化誘導細胞損傷。超氧化物歧化酶(SOD)含量變化間接反映機體清除氧自由基的能力，丙二醛(MDA)是脂質過氧化的產物，MDA含量可以表明脂質過氧化水平，本研究發現不同濃度的尿酸鈉處理滑膜細胞后ROS和MDA的含量明顯增加，SOD的含量明顯降低，表明尿酸鈉誘導滑膜細胞發生氧化應激。正常生理狀態下，生物體內產生和消除活性氧自由基的能力處于動態平衡狀態，病理狀態下，生物體內生成過量的活性氧自由基由此抑制抗氧化防御系統，繼而激發活性氧自由基的生成和消除的動態平衡受到破壞，繼而產生大量的活性氧，發生脂質過氧化，改變生物大分子的結構和功能，引起氧化應激損傷。

當機體受到氧化應激刺激時能夠激活Keap1-Nrf2/ARE 信號，激活下游靶蛋白表達[16]。靶蛋白被激活后調節生物體內抗氧化能力，使體內從氧化應激狀態恢復到正常的生理狀態。核因子E2相關因子 2調控的目的蛋白主要有血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)。今年研究發現外源性有毒的物質和ROS能促進核因子E2相關因子 2入核。SOD是生物體中最重要的酶之一，是機體內氧自由基的頭號殺手， SOD 與疾病的發生發展都有著密切聯系，具有抗炎、抗病毒及抗衰老等作用[17]。實驗研究表明激活的核因子E2相關因子 2能夠促進SOD的表達，從而可降低體內的氧化應激損傷，表明促進核因子E2相關因子2下游的抗氧化蛋白的表達，對滑膜細胞具有一定的保護作用。研究發現Nrf2誘導激活HO-1表達被認為是抗氧化應激最重要機制之一[18]與本實驗結果相符。

本實驗研究發現：模型組滑膜細胞中ROS和MDA含量明顯增加，SOD含量明顯降低，豨薟草高、中、低組都能夠明顯降低ROS和MDA含量，SOD含量明顯升高； 表明豨薟草具有抗氧化作用，且可以通過調節Nrf2/HO-1通路促進下游抗氧化基因 HO-1 的表達起到抗氧化作用，從而減少氧化應急對滑膜細胞損傷，使生物體內產生和消除活性氧自由基的能力處于動態平衡狀態進而維持正常滑膜細胞生理功能。

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