萊菔硫烷對(duì)酒精誘發(fā)肝臟脂肪代謝異常的 預(yù)防作用及機(jī)制研究

李寶龍，趙瑤潔，劉旭，李松濱，劉永武，姜波，單毓娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150090)

肝臟作為人體重要的代謝器官，是受酒精毒害的首要器官之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球3.8%的死因是由于攝入酒精所致[1]。酒精性肝損傷或酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于長(zhǎng)期大量飲酒所致，酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)為其初期表現(xiàn)，后期可進(jìn)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。由于酒精攝入的特殊性，從藥食資源中尋找拮抗或者減弱酒精毒害的活性成分是防控酒精危害的重要策略。萊菔子在中國(guó)有著悠久的食用、藥用歷史，其活性成分萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)富含于十字花科植物中，具有代謝解毒、抗氧化、抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)等活性[2-4]，被認(rèn)為是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的食源性活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SFN可通過(guò)抗氧化和降低炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)同型半胱氨酸引起的肝細(xì)胞損傷[5]，并對(duì)酒精導(dǎo)致肝損傷相關(guān)代謝酶的損傷具有效保護(hù)[6]；由于脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)也是酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)基礎(chǔ)，因此推測(cè)SFN可能通過(guò)脂代謝調(diào)控對(duì)酒精性肝損傷有保護(hù)作用。為驗(yàn)證該假設(shè)，本研究對(duì)SFN是否在急性酒精性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用進(jìn)行了探討，并從脂肪代謝和抗氧化角度，對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

萊菔硫烷購(gòu)自LKT laboratories公司(英國(guó));GSH和GST檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司(南京);Bradford 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(上海)；TG和CHOL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技公司(北京)；免疫組化一抗anti-Nrf2，anti-β-actin，anti-SREBP-1c購(gòu)自Santa Cruz生物科技公司(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

5周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2016-0011，在屏障環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天之后進(jìn)行正式分組及實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水、攝食。SPF級(jí)小鼠維持飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，經(jīng)60Co輻照滅菌，合格證號(hào)SCXK(京)2014-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，許可證號(hào)SYXK(黑)2013-004，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度22～24℃,相對(duì)濕度40%～60%、照明12 h/12 h晝夜交替進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

60只雄性C57BL/6小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,每組12只,陰性對(duì)照組、酒精模型組、SFN處理組(低劑量組10 mg/kg、中劑量組20 mg/kg、高劑量組40 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，給處理組動(dòng)物經(jīng)口灌胃不同劑量的SFN 10d(1次/d)。參照Carson和Pruett的方法構(gòu)建急性酒精性肝損傷模型，在末次灌胃SFN后，立即給予酒精模型組和SFN處理組動(dòng)物酒精(5 g/kg)，每12 h 1次，共給予3次，末次給予酒精4 h后，眼球取血制備血清，頸椎脫臼處死動(dòng)物。陰性對(duì)照組給予等熱量的葡萄糖。

1.4 肝勻漿制備及氧化還原指標(biāo)的測(cè)定

每只小鼠取肝左葉0.5 g于預(yù)冷生理鹽水(NS)中漂洗數(shù)次后濾紙吸干，加入4.5 mL預(yù)冷N(xiāo)S勻漿。用眼科剪盡快剪碎組織塊，并于玻璃器中制成10%肝組織混懸液，然后在4℃條件下以10 000 r/min離心20 min，取上清(肝勻漿)分裝于EP管中，置于-80℃冰箱中冷凍保存。用酶標(biāo)儀按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性。

1.5 血清脂肪代謝指標(biāo)測(cè)定

血清中TG、CHOL和HDL水平的測(cè)定采用中生北控生物科技公司的試劑盒，用半自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.6 免疫組化法檢測(cè)Nrf2蛋白的表達(dá)

用二甲苯對(duì)肝臟組織切片進(jìn)行脫蠟，乙醇濃度遞減梯度進(jìn)行復(fù)水并滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用10%羊血清封閉非特異性信號(hào)。隨后在4℃下與anti-Nrf2特異性抗體雜交過(guò)夜，隨后與二抗孵育30 min。用DAB顯色2 min，蘇木精復(fù)染和封片。高倍鏡(1 000倍)下觀察五個(gè)視野共約2 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行拍照。

1.7 組織蛋白的提取及SREBP蛋白表達(dá)的測(cè)定

取-80℃保存的肝組織，放入研缽中，加入適量液氮研磨，按1%比例加0.1 mol/L PMSF和磷酸酶抑制劑，使均勻覆蓋細(xì)胞，4℃放置1 h(期間搖勻3～5次)，4℃ 13 000 r/min 離心20 min，上清即為組織總蛋白。總蛋白含量測(cè)定采用Bradford方法，蛋白分離采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行，半干法轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，后用特異性一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交，室溫下顯色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 萊菔硫烷對(duì)酒精引起的高血脂的改善作用

小鼠給予急性酒精刺激后，血清TG、CHOL水平明顯升高，相比于陰性對(duì)照組，TG升高了82%，CHOL升高了49%,而HDL未有明顯變化,見(jiàn)表1,與模型組相比，低、中、高劑量SFN預(yù)保護(hù)能使TG水平下降45%～56%，(表1，P<0.01)；中、高劑量的SFN使CHOL得水平下降28%～30%，并接近了陰性對(duì)照組的水平；SFN對(duì)HDL的影響不大。

表1 SFN對(duì)小鼠血清中TG、CHOL和HDL水平的影響

注：與陰性對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 萊菔硫烷對(duì)GSH水平和GST活性的影響

由表2可知，急性酒精刺激能使肝組織中抗氧化物GSH含量下降約34%(P<0.05)，表明肝臟的抗氧化能力下降；GST活性降低34%，表明肝臟的解毒功能下降，提示急性酒精刺激損害了肝臟的正常功能。而在SFN預(yù)保護(hù)各組中，GSH的含量均明顯增加，約提高57%～79%，SFN各劑量組之間GSH水平無(wú)顯著性差異；SFN各作用組可使GST活性提高43%～80%(P<0.01)；SFN對(duì)GST能完全逆轉(zhuǎn)急性酒精對(duì)GST活性的抑制作用，SFN預(yù)保護(hù)各組GST的活性仍保持在陰性對(duì)照組水平。

表2 SFN對(duì)小鼠肝組織中GSH和GST的影響

注：與陰性對(duì)照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 SFN對(duì)小鼠肝組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響

圖1 SFN對(duì)肝組織中Nrf2表達(dá)的影響(×1 000) 注：A：陰性對(duì)照組;B：模型組;C：低劑量組;D：中劑量組;E：高劑量組

由圖1可見(jiàn)Nrf2被染成棕色顆粒，陰性對(duì)照組小鼠僅在肝細(xì)胞胞漿有Nrf2的弱陽(yáng)性表達(dá)，呈淺棕色，此時(shí)細(xì)胞核藍(lán)染，無(wú)可見(jiàn)的棕色顆粒，提示細(xì)胞核中午Nrf2表達(dá)。急性酒精刺激后，肝細(xì)胞漿中可見(jiàn)少量Nrf2的表達(dá)，細(xì)胞核中亦有少量表達(dá)。SFN預(yù)保護(hù)后，可見(jiàn)相應(yīng)組織中Nrf2表達(dá)明顯增強(qiáng)，特別是核內(nèi)Nrf2的表達(dá)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均可見(jiàn)大量、深染的棕色顆粒。

2.4 小鼠肝組織中轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)因子合成蛋白的表達(dá)

如圖2所示，急性酒精刺激后，肝組織中的固醇調(diào)節(jié)元件合成蛋白(SREBP-1c)表達(dá)增加；SFN預(yù)保護(hù)各組，SREBP-1c的表達(dá)與酒精模型組相比，有明顯降低，特別是中、高劑量的SFN的抑制作用較明顯。

圖2 SFN對(duì)小鼠肝組織中SREBP-1c蛋白的表達(dá)

3 討論

萊菔硫烷是十字花科植物蘿卜成熟的種子中的一種有效成分。《本草綱目》記載萊菔子可 “消食，除脹，利大小便，止氣痛”；著名醫(yī)家張錫純認(rèn)為，萊菔子具有“順氣開(kāi)郁，消脹除滿”的功效。可用于脘腹脹滿，氣滯腹痛的治療。酒精性肝損傷患者可出現(xiàn)上腹部脹痛、惡心、嘔吐、納差等癥狀，可歸屬為中醫(yī)疾病之腹痛。萊菔子的提取物萊菔硫烷消食除脹痛的作用機(jī)制可能與抑制膽固醇及甘油三酯合成有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，SFN能夠保護(hù)酒精對(duì)肝臟脂肪代謝的損傷作用，其作用機(jī)制與激活Nrf2的表達(dá)以及其下游GSH和GST升高有關(guān)；此外SFN可通過(guò)抑制膽固醇合成的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c表達(dá)，而抑制膽固醇和甘油三酯的合成。

SFN主要是以Nrf2依賴(lài)方式誘導(dǎo)抗氧化酶和II相解毒酶的表達(dá)。通常情況下Nrf2位于胞漿中，與其抑制劑Keap1相結(jié)合而鉚釘在胞漿骨架蛋白上。當(dāng)酒精攝入后，肝臟代謝產(chǎn)生的氧自由基會(huì)促使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，隨后Nrf2通過(guò)核穿梭機(jī)制在胞核中聚集，并與Maf蛋白等形成異二聚體后，與ARE結(jié)合介導(dǎo)Ⅱ相代謝解毒酶/抗氧化物酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7]。作者認(rèn)為，酒精模型組動(dòng)物在攝入酒精后，由于機(jī)體代謝產(chǎn)生的活性氧自由基，會(huì)促發(fā)Nrf2在小范圍內(nèi)表達(dá)增加和核轉(zhuǎn)移，這是機(jī)體的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，而當(dāng)大量的活性氧自由基生成后，如果沒(méi)有其他清除機(jī)制激活，將導(dǎo)致肝臟的損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFN預(yù)保護(hù)后，由于激活了Nrf2的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，使其調(diào)控的Ⅱ相解毒酶GST活性增加，同時(shí)SFN還通過(guò)直接增加GSH的含量[9]，達(dá)到更強(qiáng)的抗氧化能力。

SREBP-1是一種核轉(zhuǎn)錄因子，直接參與脂肪酸、甘油三酯合成和葡萄糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，屬于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)中的一種[10-11]。本研究中，急性酒精刺激引起了SREBP-1c的表達(dá)，后者將激活其下游的相關(guān)靶基因如乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、甘油-3磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(GPAT)等的表達(dá)和激活，從而導(dǎo)致脂肪酸合成增多[12]，肝臟脂質(zhì)代謝障礙甚至酒精性脂肪肝的發(fā)生，這是肝臟病理學(xué)表現(xiàn)以及血清中TG和CHOL升高的內(nèi)在原因。SFN通過(guò)抑制SREBP-1c的表達(dá)，阻止了上述病理過(guò)程的激活，因而達(dá)到了保護(hù)肝臟損傷的效果。

綜上，SFN通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2增強(qiáng)了抗氧化作用，同時(shí)通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c，改善了酒精所致的肝臟脂肪代謝的異常，二者綜合作用最終對(duì)急性酒精性肝損傷發(fā)揮了保護(hù)作用。

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