理沖生髓飲有效組分對卵巢癌組織的 相關(guān)基因表達(dá)與血管生成影響

郭瀅,張艷,韓鳳娟*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010)

卵巢癌是女性死亡率極高的女性生殖器惡性腫瘤，嚴(yán)重的影響女性的生活，現(xiàn)在對卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是手術(shù)加化療，但是存活率仍不樂觀，越來越多的人們開始關(guān)注靶向治療以及基因方面治療，本課題就理沖生髓飲對卵巢癌裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究其基因?qū)用妫诨蛐酒Y(jié)果分析中藥復(fù)方理沖生髓飲對卵巢癌血管生成影響及抑制腫瘤血管生成的作用機(jī)制。目前基因芯片具有信息量大、可比性強(qiáng)、標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，并且采用基因芯片方法篩選中藥復(fù)方有效組分作用生物學(xué)基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c裸鼠，雌性，40只，體質(zhì)量(15±2)g，無特定病原體級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，鼠齡4～6周，購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心(屬于清潔級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室隔離屏障系統(tǒng))，并且嚴(yán)格控制的裸鼠飼養(yǎng)環(huán)境。

1.1.2 細(xì)胞株

人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株，來自于齊氏生物科技。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物以及藥物試劑

中藥復(fù)方理沖生髓飲的組成：人參30 g，仙靈脾50 g，三棱10 g，莪術(shù)10 g，鹿茸10 g，黃芪50 g，水蛭10 g，浙貝母20 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局提供。

PRMI-1640(HyClone)、胎牛血清(HyClone)、0.25%胰蛋白酶(HyClone)、二甲基亞楓(二甲基亞楓)、貝伐單抗(瑞士羅氏制藥公司)、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自Thermo;STAT3兔抗人多克隆抗體、CD34兔抗人多克隆抗體和beta-actin兔抗人多克隆抗體Vegf兔抗人多克隆抗體均購自武漢三鷹公司、JAK2兔抗人多克隆抗體購自于Abcam;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)來自美國 中杉金橋(Zb-2301);免疫組化檢測試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器

掃描儀、雜交爐、程序降溫儀、研究級倒置顯微鏡、2100振蕩器、PCR儀、離心機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、-70℃低溫冰箱、SDS電泳儀、紅外微定量分析、生物組織包埋機(jī)、轉(zhuǎn)輪式組織切片機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有效組分的提取

理沖生髓飲有效組分由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理研究室人員提取供給。提取方法[1]：稱取一定處方量中藥復(fù)方，分別進(jìn)行超臨界萃取獲得組分Ⅰ，組分Ⅱ是用藥渣經(jīng)過75%乙醇浸泡，加熱回流提取液，將其蒸干；組分Ⅲ由濾渣繼續(xù)經(jīng)蒸餾水加熱回流獲得濾液，經(jīng)95%乙醇達(dá)到醇沉，上清蒸干獲得；最后收集沉淀，干燥后獲得組分Ⅳ。

保存方法是將提取組分Ⅰ密封在-20℃保存，有效組分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ密封在干燥室溫保存待用。中藥復(fù)方理沖生髓飲提取有效組分由：9.9 g組分Ⅰ、33.69 g組分Ⅱ、4.05 g組分Ⅲ以及12.5 g組分Ⅳ組成，混合在一起應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。各組劑量為，中藥高劑量組：11.28 g/(kg·d)，中藥中劑量組：7.52 g/(kg·d)，中藥低劑量組:3.76 g(/kg·d)。

1.2.2 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的培養(yǎng)

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/mL 的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、飽和濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2～3 d傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行造模。

1.2.3 卵巢癌裸鼠模型建立及評估

建立裸鼠應(yīng)用1 mL的無菌注射液，皮下肌注造模方法，將SKOV-3單細(xì)胞懸液0.1 mL注射于裸鼠左上肢以及右上肢腋下疏松部位。

待造模成功，對裸鼠每日的食量以及飲水情況進(jìn)行觀察，需要記錄小鼠的腫瘤標(biāo)本體積，隔日一測。計(jì)算方法為：V=(a×b2)/2(a為長徑，b為短徑)。

模型評估：皮下腫瘤長至直徑3 mm時(shí)即為造模成功；分離2只裸鼠皮下腫瘤，進(jìn)行病理分析評估造模是否成功。

1.2.4 分組及給藥

將裸鼠隨機(jī)分為模型組(生理鹽水)和中藥中劑量組，每組8只。以中劑量7.52 g/(kg·d)劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥21 d，觀察裸鼠的變化。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)取材及觀察指標(biāo)

斷頸處死，分離皮下卵巢癌腫瘤組織，凍存管分裝，快速置于液氮中保存，并且留取部分組織固定在中性福爾馬林液中。

1.2.6 基因芯片檢測中藥治療后差異表達(dá)基因

在空白對照組與中藥中劑量組中隨機(jī)選取4個(gè)腫瘤組織標(biāo)本，應(yīng)用人4×180KAffymetrix OElncRNA芯片技術(shù)的方法，對組織樣本進(jìn)行檢測和分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)采集和標(biāo)準(zhǔn)化

雜交芯片掃描得到原始圖像。再利用AGCC軟件技術(shù)。將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Expression Console軟件，應(yīng)用RMA算法可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法

基因表達(dá)分析使用Genespring軟件。差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，利用T檢驗(yàn)進(jìn)行篩選。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 理沖生髓飲有效組分用藥后差異基因篩選

芯片雜交后的原始圖像采用Affymetrix GeneChip Command Console軟件處理，將原始數(shù)據(jù)，用Expression Console軟件其芯片進(jìn)行了gene level的標(biāo)準(zhǔn)化。再采用Genespring軟件進(jìn)行基因表達(dá)分析。講差異基因通過T檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行篩選，篩選出以標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。

MicroRNA芯片初步篩選差異基因的結(jié)果提示上調(diào)基因3個(gè)，下調(diào)9個(gè)，共有12個(gè)表達(dá)差異的基因(見表1)。

2.2 聚類分析結(jié)果

將差異microRNA應(yīng)用非監(jiān)督層次聚類。計(jì)算多個(gè)樣品兩者之間的距離，用挑選的差異microRNA的表達(dá)情況計(jì)算樣品的相關(guān)性，并且用Heatmap展示結(jié)果如圖1顯示。

圖1 兩組間的差異基因非監(jiān)督層次聚類

圖2 GO分析

從差異基因中篩進(jìn)行兩組間的非監(jiān)督層次聚類，計(jì)算差異基因中兩兩之間的距離，將其構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，并且計(jì)算出新類和當(dāng)前各類的距離，再進(jìn)行合并和計(jì)算，以此方法直到只有一類為止，再用Heatmap展示，可以見到兩組間有明顯不同的表達(dá)譜。

結(jié)果顯示：與模型組比較，顯示中藥復(fù)方理沖生髓飲組差異表達(dá)基因上調(diào)的13個(gè)，下調(diào)的47個(gè)。

2.3 GO分析

將差異基因進(jìn)一步進(jìn)行GO分析，是描述基因主要影響的生物學(xué)功能，并用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的進(jìn)行計(jì)算，觀察靶基因富集性。結(jié)果見圖2。

2.4 Pathway分析

通過靶基因Pathway進(jìn)行分析，得到富集靶基因Pathway 條目，再應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫對進(jìn)行pathway的分析，統(tǒng)計(jì)pathway條目的差異基因顯著性的差異(用P值代表)，結(jié)果見圖3。

圖3 Pathway分析

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上對用中藥復(fù)方理沖生髓飲作用后的基因差異表達(dá)顯示可能涉及的信號通路有27條信號通路，但是再進(jìn)一步GO分析和pathway分析結(jié)合的結(jié)果可以看出最終影響卵巢癌的差異基因主要的存在的生物學(xué)途徑集中在JAK-STAT信號通路，HIF-1信號通路，NF-κB信號通路；TNF信號通路；t細(xì)胞受體信號通路；BAG信號通路；干擾素調(diào)節(jié)因子以及一些趨化因子上，并且相關(guān)的差異通路具體作用如下見表2。

3 討論

基因芯片又被稱為DNA微陣列或DNA芯片, 應(yīng)用已知核酸序列與互補(bǔ)的靶序列雜交,根據(jù)雜交信號進(jìn)行定性與定量分析，專門用于核酸檢測的生物芯片,目前的研究中主要是將“疾病-正常”的差異基因的表達(dá)進(jìn)行分析和比較，而中藥往往是由于所含有效成分復(fù)雜及作用機(jī)制多靶點(diǎn)、多途徑的雙重復(fù)雜性的特點(diǎn),目前研究中重點(diǎn)是將中藥復(fù)方的成分理清，將中藥復(fù)方組成的分子配體與靶點(diǎn)(疾病)間存在的復(fù)雜關(guān)系(如“一對多、多對一”)理清，這是目前研究中藥作用機(jī)制的關(guān)鍵，并且這種復(fù)雜關(guān)系制約了中藥復(fù)方的國際化發(fā)展。故本課題團(tuán)隊(duì)在中藥復(fù)方研究中,采用了以基因芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的基因表達(dá)差異比較,在理沖生髓飲有效組分的提取下，我們又將中藥復(fù)方的有效組分與基因表達(dá)差異相結(jié)合，觀察理沖生髓飲是否能改變基因的某個(gè)差異表達(dá)，甚或者是對通路的某位點(diǎn)或趨化因子有改變，對基因表達(dá)進(jìn)行研究,為中藥復(fù)方作用機(jī)制提供有效依據(jù)[2-3]。

表2 差異信號通路的主要作用

我們篩查的結(jié)果上可以看出，中藥復(fù)方理沖生髓飲在作用靶點(diǎn)上可以通過以上幾個(gè)通路，并且有8條差異信號通路與卵巢癌的血管生成有密切關(guān)系，對血管生成，細(xì)胞活化，以及參與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移上均有一定的作用，在對中藥分子配體與靶點(diǎn)間的“一對多、多對一”的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)研究體系下，我們可以看出，中藥復(fù)方理沖生髓飲能夠改變應(yīng)用后卵巢癌組織的相關(guān)通路，這正是目前我們研究中藥復(fù)方理沖生髓飲的作用機(jī)制研究的關(guān)鍵。鑒于基因表達(dá)譜芯片主要用于研究轉(zhuǎn)錄水平上基因的變化，可以證實(shí)理沖生髓飲參與卵巢癌的細(xì)胞再生以及轉(zhuǎn)移通路，并且是對JAK-STAT信號通路下調(diào)的作用，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，利用基因芯片的技術(shù)來闡明中藥復(fù)方理沖生髓飲有效組分在疾病以及藥物或者其它因素的干擾下，其基因的表達(dá)差異情況，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析差異基因，進(jìn)一步明確致病基因或藥物的作用靶點(diǎn)[8]，為我們在今后的實(shí)驗(yàn)過程中，可以更加有說服依據(jù)，在這些差異基因的表達(dá)下進(jìn)行更進(jìn)一步研究，找到理沖生髓飲作用于卵巢癌的機(jī)，為臨床提供更有利的生物學(xué)基礎(chǔ)。

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