薏苡仁谷蛋白源ACE抑制肽的分離純化

李開，陳佩瑤，劉露，王靈芝

(北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102400)

高血壓是心血管疾病的重要影響因素之一，常伴隨中風及腎衰竭的發生，嚴重威脅著人類健康[1]。ACE(血管緊張素轉化酶)抑制劑為臨床常用降壓類藥物，它通過阻斷無活性的血管緊張素Ⅰ轉化為具有升壓活性的血管緊張素Ⅱ及抑制緩激肽的降解來達到降壓作用[2]。目前臨床上此類常用藥物有卡托普利、依那普利、賴諾普利等，然而卻存在著咳嗽，味覺失常，皮疹等明顯副作用[3]。天然來源的ACE抑制肽因其安全性高，毒副作用小，易吸收的特點逐漸引起人們的重視[4-6]。

薏苡仁為禾本科植物薏苡(Coixlarchryma-jobiL.var.ma-yuenStapf)的干燥成熟種仁，主產于福建、河北、遼寧等地，味甘淡，性寒， 歸脾、胃、肺經，可利水滲濕、健脾、除痹、排膿[7]。薏苡仁主要含有甘油三酯、薏苡內酯、薏苡多糖、甾醇類化合物、生物堿類化合物以及蛋白質，氨基酸等有效成分[8-9]，有抗炎、抗癌、抗腫瘤、降血糖及降壓等功效[10-14]。本課題前期工作表明薏苡仁谷蛋白酶解物具有ACE抑制活性[15]，本研究進一步采用超濾和色譜方法對其分離純化，以期獲得新型結構降壓肽，從而提供新型中醫藥源降壓候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

薏苡仁(北京同仁堂藥店)；胃蛋白酶(Sigma公司)；ACE(Sigma 公司)；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL,Sigma 公司)；馬尿酸(HA，Sigma 公司)；卡托普利(中國藥品生物制品檢定所)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Biomiga公司)。

1.2 儀器

SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器(金壇市華立實驗儀器廠)；Biofugestratos 高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific)；德國CPA2250 型萬分之一電子分析天平(Sartorius Weighing Technology Gmbh)；85-2型恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；Waters 1525 高效液相色譜儀(Waters 公司)；EPOCH 全波長酶標儀( 美國伯騰儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(上海佑科儀器儀表有限公司)；HD-4核酸蛋白檢測儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 薏苡仁谷蛋白酶解物的制備

參照課題組Yuan[14]報道的方法進行薏苡仁谷蛋白酶解物的制備。準確稱取薏苡仁谷蛋白凍干粉，按照底物濃度2%(w/v),胃蛋白酶與底物比1∶10(w/w)，pH=2.0(溶于0.01 mol/L HCl)37 ℃恒溫水浴48 h，反應結束后，100 ℃水浴5 min終止反應，冰浴至10 min，10 000 rpm 4 ℃離心，過G4漏斗，取收集液，置于卷式超濾機中進行超濾，截留分子量為3 KDa，超濾壓力0.1 MPa，溫度25 ℃，循環15 min后，收集濾出液，冷凍干燥。

1.3.2 離子交換色譜分離

將DEAE Sepharose Fast Flow填裝玻璃層析柱(2 cm×15 cm)，采用二乙醇胺緩沖液(pH=8.8)平衡。取上述多肽組分溶于緩沖液，過0.45 μm微孔濾膜，上樣，流速為1 mL/min,用0～0.2 M濃度梯度的NaCl-二乙醇胺緩沖液進行洗脫，HD-4核酸蛋白檢測儀于220 nm波長下檢測組分，根據峰形收集流出液組分，定量后進行ACE抑制活性評價，選擇較高活性組分進行下步分離純化。

1.3.3 反相高效液相色譜分離

樣品溶于質譜級水，經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液上RP-HPLC(反相高效液相)系統進行分離純化，色譜柱為：TIAN-1825 Kromasil C18 column(250 mm×4.6 mm)，色譜條件：柱溫30℃,流速1 mL/min，檢測波長220 nm；流動相A：乙腈(含0.1%TFA,v/v)，流動相B：超純水(含0.1%TFA,v/v)；洗脫條件:0～5 min 5% A，5～85 min 5%～25% A。根據洗脫峰收集各組分，冷凍干燥，蛋白定量后對各組分進行ACE抑制活性評價。

1.3.4 ACE抑制活性測定

采用RP-HPLC法進行ACE抑制活性測定[15]。將定量后的樣品采用硼酸緩沖液溶解，以硼酸緩沖液作為空白對照，卡托普利為陽性對照?？偡磻w系為50 μL，其中樣品溶液10 μL、ACE溶液20 μL(2 mU)以及HHL溶液20 μL(2 mM)。樣品與ACE溶液充分混勻，37 °C恒溫水浴10 min，加入底物HHL溶液充分混勻37 ℃保溫90 min，100 μL乙腈終止反應。采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Tianhe)對反應液進行分析，色譜條件：柱溫30 ℃，流速1 mL/min，流動相為乙腈∶水(0.05%三氟乙酸)=25∶75等度洗脫，上樣體積10 μL，檢測波長228 nm，根據HA的峰面積計算ACE抑制率，公式如下：

ACE抑制率(%)=(A-B)/A×100%

式中，A為空白對照條件下所產生的HA峰面積，B為樣品或卡托普利作用條件下所產生的HA峰面積。

1.3.5 多肽含量測定

采用BCA法測定多肽含量[16]。

2 結果與分析

2.1 薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3KD組分)ACE抑制活性評價

薏苡仁谷蛋白經胃蛋白水解，超濾后，收集≤3 KD組分，進行ACE抑制活性評價，色譜圖如圖1所示，其中a、b分別為對照品HHL和HA的色譜圖，出峰時間分別為9.0和5.5 min，c為空白對照( 硼酸緩沖液) ，生成了較大的HA峰面積;d和e分別為薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3 KD多肽組分,0.01 mg/mL)和卡托普利 (2×10-9mol/L) 。與空白對照相比，≤3 KD組分的ACE 抑制率為(16.9±1.29)%,說明薏苡仁谷蛋白酶解物具有一定的降壓潛力。

圖1 樣品及對照品的RP-HPLC色譜圖 注：(a)HHL標準品；(b)HA標準品；(c)空白對照；(d)薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3 KD組分,終濃度0.01 mg/mL)；(e)卡托普利(2×10-9 mol/L)。色譜條件：流動相25%乙腈(含0.05% TFA)，流速1 mL/min，檢測波長228 nm

2.2 離子交換色譜分離

薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3 KD組分)經離子交換色譜分離后一共收集到了7個組分A1～A7(圖2)，其中A1 0M NaCl洗脫出峰，A2～A5為0.02M NaCl洗脫，A6為0.05M NaCl洗脫，A7為0.2M NaCl洗脫，在終濃度0.01 mg/mL下，測定各組分ACE抑制活性見表1，其中A2組分活性最高，抑制率為(50.48±1.93)%，與其他組分顯著性差異(P<0.05)，較上一步組分活性提高約34%，因此選擇A2組分進行下一步分離純化。

圖2 離子交換色譜圖 注：色譜條件：0～0.2 M Nacl-二乙醇胺緩沖液洗脫，檢測波長220 nm

組分ACE抑制率(%)A130．39±0．49A250．48±1．93A336．45±0．07A426．83±4．59A540．14±0．09A623．00±0．52A71．49±0．27

注：各組分終濃度為0.01 mg/mL

2.3 RP-HPLC色譜分離純化

A2多肽組分經RP-HPLC分離純化后共收集到11個組分(圖3)，冷凍干燥后，經BCA定量在0.01 mg/mL同等濃度下，測定各組分的ACE抑制活性如表2所示，其中組分B2表現出了較高的ACE抑制活性，抑制率為(73.41±1.05)%，顯著高于其他組分(P<0.05)，與上一步離子交換組分A2相比抑制率提高約23%,與初始的≤3 KD組分相比，抑制率提高了約57%，說明薏苡仁谷蛋白酶解物經系列分離純化后獲得了高活性的ACE抑制肽。

表2 RP-HPLC分離純化后各組分ACE抑制率

注：各組分終濃度為0.01 mg/mL

圖3 A2組分RP-HPLC色譜分離結果 注：柱溫30℃,流速1 mL/min，檢測波長220 nm

3 討論

薏苡仁谷蛋白酶解物經過超濾，離子交換色譜以及RP-HPLC等方法分離純化后，獲得了活性逐步提高的組分。超濾獲得的≤3KD酶解物表現出一定的ACE抑制活性(16.9±1.29)%，最終獲得組分B2，在相同濃度(0.01 mg/mL)下抑制率為(73.41±1.05)%，活性提高了約57%，有望從中獲得高活性ACE抑制肽單體。ACE抑制肽的獲得通常以動植物蛋白作為原材料，通過酶解或者發酵的方式獲得肽段，進一步采用超濾和多種色譜技術對其進行分離純化，經質譜鑒定其氨基酸序列[17-21]。Liu等[22]對胡桃蛋白進行酶解后通過超濾、葡聚糖凝膠色譜、離子交換色譜以及高效液相色譜分離純化，獲得ACE抑制肽Trp-Pro-Glu-Arg-Pro-Pro-Gln-Ile-Pro，其IC50為25.67 μg/mL。Li等[23]從泥鰍蛋白水解物中獲得了Ala-His-Leu-Leu，可使SHR(原發性高血壓大鼠)血壓下降22.1 mmHg。Abraham等[24]從火麻仁蛋白酶解物中獲得了降壓肽Pro-Ser-Leu-Pro-Ala，單次灌胃給藥(30 mg/kg body weight)SHR，4 h后血壓下降了40 mmHg。天然來源的ACE抑制肽類藥物與合成藥物相比具有安全性高，毒副作用小的優點，引起人們的重視[25-26]。薏苡仁作為我國傳統中藥，有健脾滲濕的功效,中醫上認為脾虛濕濁內阻，繼而濕濁上犯，為高血壓病的重要病機之一，健脾滲濕是治療高血壓的重要法則[27]，也是薏苡仁用于高血壓治療的中醫藥基礎理論，本工作及課題組工作[15]表明，薏苡仁谷蛋白經胃蛋白酶消化后最終獲得具有較高ACE抑制活性的B2組分，可為該藥臨床應用提供新的科學依據，同時為中醫藥源多肽類降壓新藥的研發提供新的候選材料。

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