斷體地龍促進創傷愈合活性成分篩選研究

段曉杰，楊雨薇，賡迪，羅世林，王雄飛，丁玉婷，鄭竹宏，趙仁云，孫毅坤

(北京中醫藥大學，北京 102488)

據一項最新研究報道，創傷已成為中國除腦中風和冠心病之后的第三大死亡原因[1]。可見創傷已嚴重威脅到了國人身體健康[2]，需引起高度重視。而傳統中醫藥在治療創傷愈合方面有著自身獨特的優勢。地龍，又名“蚯蚓”，作為傳統中藥，在我國應用已有上千年歷史。地龍主要含有酶類、蛋白質、多肽、脂類及微量元素等，有抗凝血、抗血栓、降壓、抗腫瘤[3]、解熱抗炎鎮痛、加速傷口愈合等作用[4]。

課題組前期研究發現，斷體三天的地龍提取液含有促進創傷愈合的物質，并發現鹽析后得到的飽和度為45%～60%的組分活性最強，本實驗將采用DEAE-Sepharose Fast Flow對該組分進行進一步分離，并通過測定其對NIH3T3增殖作用的影響篩選活性較強組分，為探討斷體地龍促進創傷愈合的活性成分奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

核酸蛋白酶檢測儀(HD-4，上海滬西分析儀器有限公司);pHS-3C型酸度計(上海偉業儀器廠);萬分之一天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);紫外分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限公司);潔凈工作臺(HD-1360，北京東聯哈爾儀器制造有限公司);血球計數板(上海市求精生化試劑儀器有限公司);細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific);倒置顯微鏡(OPTEC BDS200，重慶市奧特光學儀器有限責任公司);離心機(Anke TDL-50B，上海安亭科學儀器廠);酶標儀(ELX800，湘智離心機廠)。

1.2 實驗藥材與試劑

鹽酸(分析純，北京化工廠);Tris(C4H11NO3，AMRESCO);氯化鈉(NaCl，分析純，北京化工廠);牛血清白蛋白(AMERSCO);考馬斯亮藍G-250(北京欣經科生物);DMEM培養基(GIBCO公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒，日本同仁化學公司);bFGF(美國Peprotech);雙抗(北京拜耳迪生物科技有限公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO公司);25 cm2細胞培養瓶(corning公司);無菌0.22 μm過濾膜等。

赤子愛勝蚓(天津市東麗區成功蚯蚓養殖場);NIH3T3(北京協和細胞資源中心)。

2 實驗方法

2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow分離蛋白

采用濕法裝柱[5]將DEAE-Sepharose Fast Flow裝入處理好的層析柱(2.0 cm×17 cm)中，裝好的層析柱用10倍量的平衡緩沖液(pH 7.5[6]，0.01 M Tris HCl溶液)充分平衡。樣品經0.22 μm濾膜過濾后上樣，先后用0.1～0.5 M NaCl溶液梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，收集各信號峰的洗脫液，低溫透析后于-20℃保存。

2.2 蛋白含量測定

采用Bradford法測定蛋白濃度。以牛血清白蛋白為標準蛋白，加入適量考馬斯亮藍染液和去離子水，配制濃度分別為0、3.7、7.4、11.1、14.8、18.5 mg/mL的標準蛋白溶液，分別于595 nm波長處測定吸光度值。分別取200 μL的1～5號洗脫液，用去離子水稀釋至1 mL后加入適量染液，用紫外分光光度計測定吸光度。

2.3 活性組分篩選

2.3.1 NIH3T3細胞培養

“速融法”復蘇NIH3T3細胞，用DMEM高糖完全培養液(含10%的胎牛血清、1%的雙抗)于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養。細胞鋪滿80%～90%時進行傳代培養。

2.3.2 分組與給藥方法

實驗分為給藥組(1～5號給藥組)、陰性對照組和陽性對照組。給藥組加入含有一定濃度藥物的完全培養液，每組均設六個蛋白濃度(分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 μg/mL)，陰性對照組只加完全培養液，陽性對照組加含有0.1 μg/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的完全培養液，每組設3個復孔，另設調零孔。

細胞生長至對數期后進行傳代，Trypan Blue法計數后將細胞稀釋至一定濃度，吹打均勻，使得每100 μL含有5 000個左右細胞。按照每孔100 μL將細胞接種到96孔板上，培養箱中培養24 h后取出培養板，棄去舊的培養液，分別加入等量的新鮮的含藥培養液、完全培養液及含有bFGF的完全培養液。給藥后將培養板放回培養箱中繼續培養。

2.3.3 CCK-8法測定細胞增殖率

給藥48 h后，取出培養板，同時按照一定比例配制含有CCK-8的完全培養液。棄去舊的培養液，每孔加入含有CCK-8的完全培養液110 μL(含DMEM完全培養液100 μL，CCK-8溶液10 μL)。在培養箱中孵育1.5 h后用酶標儀測定吸光度，計算增殖率。陰性對照組以100%計。

2.4 統計學處理

采用SPSS19.0軟件，對數據進行單因素方差分

3 實驗結果

3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫圖譜

樣品經陰離子交換層析分離結果見圖1。由圖1可知，用0.1 M～0.5 M NaCl溶液梯度洗脫后，一共得到5個洗脫峰(每個濃度均得到一個洗脫峰)。

圖1 離子交換層析洗脫圖譜注：1：0.1 M NaCl 洗脫峰；2：0.2 M NaCl 洗脫峰；3：0.3 M NaCl 洗脫峰；4：0.4 M NaCl 洗脫峰；5：0.5 M NaCl 洗脫峰

3.2 不同洗脫液的蛋白含量

以牛血清白蛋白濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得回歸方程A=15.598C+0.02(R=0.988 3)。經計算得1～5號洗脫液蛋白濃度分別為0.137、0.150、0.154、0.127、0.165 mg/mL。由此可見各洗脫峰蛋白含量差異較小，峰4含量較低，峰5含量相對較高。

3.3 不同洗脫液對NIH3T3細胞增殖率的影響

洗脫液對NIH3T3細胞增殖作用的影響見表1。由表1可知，在一定濃度下，各洗脫液對NIH3T3細胞均有促進增殖的作用，陽性對照組(bFGF)與實驗組、陰性對照組相比具有顯著性差異。當蛋白濃度為1.5 μg/mL時，各組細胞增殖率達到最大值，分別為115.39%、115.78%、124.99%、121.58%和109.34%。

表1 不同離子交換成分對NIH3T3增殖率的影響

注：與陰性對照組比較，#P<0.05,##P<0.01

根據表1繪制各實驗組細胞增殖率曲線圖，見圖2。由圖2可看出，各實驗組細胞增殖率呈現相近的趨勢，在蛋白濃度≤1.5 μg/mL時細胞增殖率均隨著蛋白濃度的升高而增大，之后隨著蛋白濃度的升高增殖率呈下降趨勢。其中2、4、5號洗脫液組在蛋白濃度高于2.5 μg/mL時呈現細胞生長抑制的現象。當蛋白濃度為1.5 μg/mL時，各組細胞增殖率均達到最大值，其中3號洗脫液組增殖率最大，且該組在各蛋白濃度下對細胞增殖促進作用較穩定。

圖2 不同洗脫液促進NIH3T3細胞的增殖率曲線

4 討論

創傷愈合主要包括三個階段：炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期[7]。成纖維細胞是肉芽組織形成的關鍵細胞，其增殖可認為是組織形成的先兆[8]。而bFGF能促進成纖維細胞增殖分化[9],因此實驗中以bFGF為陽性對照，通過觀察實驗組對成纖維細胞增殖作用的影響來篩選提取液中促進創傷愈合的活性成分。

本實驗是將課題組前期得到的活性組分通過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱進行純化，采用不同濃度的NaCl溶液梯度洗脫先后得到5個洗脫液。對蛋白進行含量測定后，采用不同濃度的各洗脫液作用于NIH3T3細胞，并通過CCK-8法檢測細胞的增殖率。結果發現，3號洗脫液對細胞增殖促進作用最強，且促增殖作用呈濃度依賴關系，但蛋白濃度過高時細胞生長呈現抑制作用。表明其可能含有促進創傷愈合的成分，后期可結合凝膠過濾層析和SDS-PAGE對活性蛋白進行純化研究。

本研究通過NIH3T3增殖實驗篩選促進創傷愈合的活性成分，尚有不足之處，其體內活性及具體作用機制尚不明確，有待進一步的探討。

[1] 鐘世鎮.關于創傷急救的幾個問題[J].中華神經創傷外科電子雜志,2015,1(2):1-2.

[2] 王正國.創傷醫學發展的思路[J].中華神經創傷外科電子雜志,2015,1(1):2-3.

[3] 毛承飛,崔永安,左小東.地龍抗腫瘤研究進展[J].中醫藥學報,2006,34(5):50-52.

[4] 杜航,孫佳明,郭曉慶,等.地龍的化學成分及藥理作用[J].吉林中醫藥，2014,34(7)：707-709.

[5] 劉冬涵,王炎,田玉欣,等.苦菜地上部分總黃酮富集工藝研究[J].中醫藥學報，2017,45(2):94-98.

[6] 段曉杰,羅世林,汪文琪,等.地龍提取液中蛋白質的穩定性研究[J].中醫藥信息,2017,34(2):31-33.

[7] 王羽儂,王順梅,唐瑩,等.中醫藥促進創面愈合機制研究進展[J].中國醫藥導報,2014,11(19):156-158.

[8] 魏巍,高建青,于蓮.新型局部給藥系統促進創傷愈合的研究進展[J].中國現代應用藥學,2014,31(11):1417-1423.

[9] 陳佳,羅成群.堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)與創傷愈合[J].中國燒傷創瘍雜志,2005,17(1):74-76.