新型流感病毒快速實驗室鑒定研究進展

王蔚+盧洪洲

2017年入冬以來，我國南北方省份流感活動水平上升較快，當(dāng)前處于冬季流感流行高峰水平。全國流感監(jiān)測結(jié)果顯示，流感樣病例就診百分比和流感病毒檢測陽性率均顯著高于過去三年同期水平，流感活動水平仍呈現(xiàn)上升態(tài)勢，本次冬季流感活動強度要強于往年。2018年1月，為有效應(yīng)對流感疫情，國家衛(wèi)生計生委和國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于做好2018年流感防治工作的通知》和《流行性感冒診療方案（2018年版）》。

2018年1月8日，由浙江大學(xué)李蘭娟院士領(lǐng)銜、上海市公共衛(wèi)生臨床中心盧洪洲教授等專家共同參與完成的“以防控人感染H7N9禽流感為代表的新發(fā)傳染病防治體系重大創(chuàng)新和技術(shù)突破”項目獲“2017年度國家科技進步獎特等獎”。這是該獎項設(shè)立以來，我國醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)、教育行業(yè)“零”的突破。該項目在發(fā)現(xiàn)新病原、確認傳染源、明確發(fā)病機制、有效臨床救治、研發(fā)新型疫苗和診斷技術(shù)等方面取得了重大創(chuàng)新和技術(shù)突破。

流感防控的諸多環(huán)節(jié)中，流感病毒的快速鑒定至關(guān)重要，但卻一直是個技術(shù)難點。為此，本刊特向上海市公共衛(wèi)生臨床中心相關(guān)專家約稿，希望廣大醫(yī)藥工作者，特別是臨床一線門急診醫(yī)護人員對流感疫情引起高度重視，并對相關(guān)檢測鑒定技術(shù)有所了解。

摘 要 流感病毒是新發(fā)突發(fā)傳染病防控重點，而臨床標(biāo)本中微量未知新型流感病毒快速鑒定一直是個難點。本文介紹最新高通量分子診斷技術(shù)研究進展，通過組合應(yīng)用熒光多重PCR、consensus PCR、一代測序和二代測序技術(shù)等不同技術(shù)，不經(jīng)過細胞培養(yǎng)分離，快速鑒定臨床標(biāo)本中新型甲型流感病毒的技術(shù)流程。

關(guān)鍵詞 新型甲型流感病毒 高通量分子診斷技術(shù) 病原體快速鑒定體系

中圖分類號：R511.7； R446 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2018）03-0001-04

Research progress on rapid laboratory identification of novel influenza A virus

WANG Wei*， LU Hongzhou**

（Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University， Shanghai 201508， China）

ABSTRACT Influenza virus is a key pathogen for the prevention and control of the emerging infectious diseases， and the rapid identification of a new novel genotype of influenza virus in clinical specimens has been a difficult problem. This paper introduces the research progress of new high-throughput molecular diagnostic techniques， and the procedure of rapid identification of novel influenza A virus from clinical samples without cell culture by using in combination of fluorescence multiple PCR， consensus PCR and next-generation sequencing technology.

KEY WORDS novel influenza A virus； high throughput molecular diagnosis technology； rapid identification system of pathogens

流感病毒是一種重要的呼吸道傳染病原體。每年流行季可導(dǎo)致數(shù)十萬人死亡。不僅如此，人類歷史上多次發(fā)生流感大流行，造成百萬甚至千萬人死亡。進入2000年以來，新型甲型流感病毒如pamH1N1病毒在2009年造成全球大流行，新發(fā)現(xiàn)H5N1、H7N9、H5N6和H10N8等禽流感病毒在全球或局部地區(qū)不斷出現(xiàn)人感染病例[1-5]。因此，流感全球大暴發(fā)的潛在威脅一直存在，是新發(fā)突發(fā)傳染病防控的重點。

流感病毒屬于正黏病毒科，根據(jù)基因組和抗原特性分為甲乙丙三個屬。甲型流感病毒為有包膜負鏈RNA病毒，基因組分成8個節(jié)段，分別編碼11個病毒蛋白（PB2、PB1、PBl-F2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NEP）。其中，血凝素HA蛋白和神經(jīng)酰胺酶NA蛋白是病毒的表面抗原蛋白，根據(jù)各自抗原特性和序列特征細分成不同亞型，已知HA蛋白常見亞型有18種，NA蛋白有11種。甲型流感病毒亞型命名是根據(jù)不同HA和NA蛋白的組合。水禽類是流感病毒的貯存宿主，攜帶了幾乎所有18種HA和11種NA亞型病毒，人感染的流感病毒亞型主要為H1、H2、H3和N1、N2。H1N1和H3N2流感病毒是人季節(jié)性流感。當(dāng)人流感病毒與某個禽流感病毒發(fā)生重組產(chǎn)生新病毒，或者某個禽流感病毒通過自身點突變的積累而獲得感染人體細胞的能力，而人類對這些新病毒并沒有免疫能力，很可能會再次發(fā)生流感大流行。

新型流感病毒疫情出現(xiàn)時，若實驗室在第一時間確診病原體，對于患者的及時救治、有效防控措施的制定等都是至關(guān)重要的。目前全新分子生物學(xué)技術(shù)在此領(lǐng)域的應(yīng)用使新病原診斷的周期不斷縮短，靈敏度和準(zhǔn)確性也不斷提高。

2013年3月初，上海市公共衛(wèi)生臨床中心在會診上海市第五人民醫(yī)院一位不明原因重癥肺炎患者時，規(guī)范地留取臨床標(biāo)本，按照未知呼吸道病原體鑒定流程，采用熒光多重PCR、consensus PCR、一代測序和二代測序技術(shù)，從臨床標(biāo)本中直接確定病原體為一種新型甲型H7N9禽流感病毒，并獲得臨床毒株全長基因組序列，對毒株的耐藥位點進行耐藥分析[6]。通常新病毒確診需要通過雞胚或細胞接種分離得到毒株然后測序得到毒株的全基因組序列[2]。由于病毒雞胚/細胞分離株不可避免地受到培養(yǎng)過程中環(huán)境選擇的壓力，導(dǎo)致毒株發(fā)生適應(yīng)性突變以及優(yōu)勢毒株優(yōu)先得到擴增，因此不能充分反映臨床標(biāo)本中病毒群落的生物學(xué)特性。為了進一步研究病毒從禽到人跨種傳播和毒力變化的原因、評估抗病毒藥物的療效以及預(yù)測病毒人際傳播的潛在可能，從患者臨床標(biāo)本中直接得到病毒全基因組序列和遺傳多態(tài)性信息已經(jīng)成為被廣泛接受的最新研究策略[4-5]。endprint

本文重點介紹采用組合應(yīng)用不同高通量分子診斷技術(shù)的策略，直接從臨床標(biāo)本入手，快速鑒定新型甲型流感病毒的技術(shù)流程。該流程包括三個步驟：流感病毒病毒診斷、甲型流感病毒分型和新型流感病毒鑒定（圖1）。

1 甲型流感病毒檢測

1.1 核酸檢測

流感病毒與鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等10多種病原體引發(fā)的呼吸道感染臨床癥狀極為相似且流行季節(jié)重疊。因此，對急性呼吸道感染患者的臨床標(biāo)本（鼻咽擦拭子、痰液、支氣管肺泡灌洗液）需要進行流感病毒和其他已知常見呼吸道病原體初步篩查。篩查采用分子檢測方法，以不同病毒基因各自高度保守序列為靶序列，設(shè)計一系列引物和探針，各個單重PCR擴增產(chǎn)物通過片段大小或熒光信號篩查陽性標(biāo)本[7-8]。

以Luminex和Perkin Elmer公司分別研發(fā)的“液相懸浮芯片”、BioFire公司研發(fā)的FilmArray等為代表的高通量病原體核酸檢測技術(shù)，采用多重PCR或多重實時熒光PCR擴增病毒核酸，再結(jié)合下游不同雜交技術(shù)的策略[9-10]。與傳統(tǒng)單個病原體特異性PCR相比，這些技術(shù)一次可同時檢測10多種甚至幾十種病原，為及時快速地篩查鑒定病原體提供了有效的手段，但是檢測成本較高和配套設(shè)備復(fù)雜昂貴等因素限制了這些技術(shù)在臨床應(yīng)用上的推廣。

1.2 血清學(xué)診斷

患者急性期（發(fā)病5 d內(nèi)）血清和恢復(fù)期血清（病程2～4周）雙份血清，在相同條件下做血凝抑制（hemaglutination inhibition， HI）試驗可作為流感病毒感染輔助診斷，但是診斷的靈敏性和特異性較差不適用于流感病毒快速診斷。

1.3 病毒分離與鑒定

流感病毒確診的金標(biāo)準(zhǔn)是毒株分離培養(yǎng)。流感病毒分離培養(yǎng)采用雞胚或猴胚腎細胞（MDCK細胞）接種臨床呼吸道標(biāo)本，3～4 d后取雞胚囊液或細胞上清液做血凝實驗或?qū)崟r熒光定量PCR檢測確定陽性結(jié)果。該方法操作要求高且耗時久，不適用于流感病毒的快速診斷。

2 甲型流感病毒分型

流感病毒是高突變病毒，其基因組的復(fù)制需要病毒PA、PB1和PB2蛋白組成的病毒RNA聚合酶復(fù)合物，復(fù)制后的基因節(jié)段與新合成的病毒蛋白裝配成子代病毒。由于病毒聚合酶缺乏5à3端核酸校正功能，因此在RNA復(fù)制過程中易出現(xiàn)錯配，導(dǎo)致子代病毒基因組和病毒蛋白氨基酸突變。突變累積會造成病毒蛋白抗原性改變，產(chǎn)生病毒對人體免疫逃逸，是人季節(jié)性流感流行的原因。同時，當(dāng)兩種以上不同亞型的流感病毒感染同一宿主細胞時，各自基因節(jié)段在子代病毒裝配過程中發(fā)生重配，從而產(chǎn)生新型重組病毒。因此，流感病毒分型對病毒的流行監(jiān)測具有重要意義。

流感病毒基因組有8個節(jié)段，其中M和NP基因高度保守，一般作為甲型流感病毒的型別鑒定。HA和NA基因則用于人季節(jié)性甲型流感病毒（H1N1和H3N2）分型。

HA和NA基因分型可采用傳統(tǒng)PCR或熒光定量PCR方法，利用已知基因序列信息進行多序列的比對（alignment），找出基因組中合適的區(qū)域段作為靶點，設(shè)計H1～H18和N1～N11不同亞型特異性引物和探針[11-12]。由于流感病毒具有高突變率，引物選擇和數(shù)據(jù)分析較為復(fù)雜。隨著病毒變異不斷積累導(dǎo)致靶序列的較大變化，需要相應(yīng)地更新或更換檢測引物。

3 新型流感病毒鑒定

由于新型甲型流感病毒是不同亞型甲型流感病毒的8個基因節(jié)段重組而來，因此新型甲型流感病毒的鑒定需要確定8個片段基因序列，通過序列比對和進化分析確定病毒亞型。

為獲得病毒8個基因節(jié)段序列，研究人員建立了基于保守序列的PCR擴增（consensus PCR）。首先，通過序列比對找到各個相對保守的序列區(qū)域設(shè)計PCR通用引物。用consensus PCR擴增所獲片段，通過直接測序得到基因序列[13]。該方法特異性強，但是要求臨床標(biāo)本中病毒有較高滴度，而且實驗周期較長。

近年發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing， HTS）能夠更簡單更全面檢測病毒全基因組序列，它通過導(dǎo)入特異性接頭序列，對每個輸入（input）的臨床標(biāo)本中的DNA分子進行大規(guī)模平行擴增和合成測序，然后通過生物信息分析，將所得每條序列與數(shù)據(jù)庫序列進行比對、拼接和組裝，從而完成病毒鑒定[14]。它的最大檢測優(yōu)勢在于不需要經(jīng)過細胞培養(yǎng)，直接對臨床標(biāo)本中的核酸池（pool）進行測序；而它的弱點在于檢測特異性較低，主要原因是建庫過程中無法完全去除宿主基因組和環(huán)境微生物基因組的污染。另外，它必需有專業(yè)生物信息平臺的支持，才能對產(chǎn)生的海量測序數(shù)據(jù)進行后期處理。因此，高通量測序技術(shù)較適用于無法體外培養(yǎng)分離的病毒、高度變異病毒、重組病毒以及新病毒的鑒定和研究[14]。

目前高通量技術(shù)平臺有3家，分別由Roche、ABI和Illumina公司開發(fā)。相對于一代Sanger測序法，這些技術(shù)被統(tǒng)稱為二代測序技術(shù)。三家研發(fā)了不同的化學(xué)擴增體系、測序信號檢測系統(tǒng)和分析軟件，其各自具體原理本文不再贅述[14]。三家平臺各有所長，根據(jù)其通量、平均讀長、準(zhǔn)確性和使用成本的差異，適合于不同研究應(yīng)用。對于新病原鑒定，一個HTS平臺最重要技術(shù)指標(biāo)是：①模板DNA最低起始量；②測序時間和成本；③測序通量；④測序讀長。相較于商業(yè)化測序服務(wù)公司配備大型HTS平臺，臨床診斷實驗室多選擇小型HTS平臺包括Miseq和Ion Torrent PGM，直接從單個臨床標(biāo)本中獲得病毒全基因組序列。

值得一提的是，盡管高靈敏度的檢測方法可以幫助發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中的病毒核酸，但如何確認被檢測到的微生物是導(dǎo)致疾病或疫情暴發(fā)的病原體，始終是病原體鑒定中的核心問題[15]。新病原體與導(dǎo)致疾病之間因果關(guān)系的論證需要遵從科赫（Koch）法則。endprint

4 結(jié)語

臨床標(biāo)本中微量已知病毒的鑒定通常根據(jù)其形態(tài)學(xué)、特異性抗原和特定基因序列，經(jīng)過或不經(jīng)過細胞培養(yǎng)分離，采用血清學(xué)和分子學(xué)檢測方法來實現(xiàn)。但是，未知新病毒的檢測一直是個難點。新型流感病毒的及時鑒定對于臨床救治和傳染病疫情控制至關(guān)重要，新的快速、高通量、高敏感性和高特異性的檢測鑒定技術(shù)正在不斷地被研發(fā)和應(yīng)用。正在研發(fā)和驗證之中的還包括納米金顆粒技術(shù)、流式細胞技術(shù)、三代測序技術(shù)與現(xiàn)有的核酸診斷技術(shù)的聯(lián)用等。未來，隨著這些技術(shù)的不斷成熟、標(biāo)準(zhǔn)化和低成本化，有望在臨床診斷和疫情防控中被大規(guī)模應(yīng)用。

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