海藻糖代謝及其調控昆蟲幾丁質合成研究進展

唐斌，張露，熊旭萍，汪慧娟，王世貴

（杭州師范大學生命與環境科學學院，杭州 310036）

海藻糖為一種非還原性糖，廣泛存在于細菌、真菌、植物和無脊椎動物中，海藻糖不僅是昆蟲血淋巴中的重要糖類和能量物質，而且在昆蟲的生長、發育、蛻皮變態等一系列生命活動活動中具有重要作用，因此被稱為昆蟲的“血糖”[1-3]。昆蟲通過海藻糖合成酶及海藻糖酶來合成和降解海藻糖，為其進行的一系列生命活動提供能源。海藻糖不僅是能量來源物質，而且是一種重要的抗逆物質，在各種環境壓力條件下保護機體免受損傷[4-7]。昆蟲的外骨骼主要由幾丁質構成，其幼蟲每生長到一定的階段都需要蛻掉舊的表皮，形成新的表皮，這個過程由幾丁質合成通路及幾丁質降解途徑來共同完成[8]。海藻糖酶是昆蟲幾丁質合成通路的第一個酶，研究表明海藻糖的合成和降解都能通過控制幾丁質合成通路從而影響昆蟲發育[9-11]。而海藻糖合成酶為海藻糖合成的限速酶，同時考慮到包括人類在內的高等哺乳動物不能自身合成海藻糖[12]，海藻糖合成途徑具有作為相對安全的控制靶標的潛力[13]。然而，昆蟲海藻糖代謝能否且又是如何調控幾丁質合成途徑的？通過昆蟲海藻糖代謝相關基因的功能研究，越來越多的研究結果表明當海藻糖供給平衡被打破會導致昆蟲幾丁質合成受阻，通路相關基因的表達顯著降低、幾丁質含量顯著下降并產生高死亡率[9,14-16]，這表明海藻糖代謝途徑適合作為害蟲的控制靶標[17-18]。

1 昆蟲幾丁質合成與海藻糖代謝

1.1 昆蟲幾丁質

幾丁質又稱甲殼素，是一種存在于昆蟲和其他節肢動物表皮、氣管系統、生殖器導管和各種皮膚腺體中的天然多糖[19-21]，約占昆蟲蟲蛻干物質的40%[22]。幾丁質是昆蟲外骨骼和圍食膜的主要成分，它的合成、轉化和修飾與昆蟲的生長發育聯系緊密[8,21,23]。昆蟲幼蟲每生長到一定的階段都需要蛻掉舊表皮，形成新表皮，這個過程由幾丁質合成通路及幾丁質降解途徑共同完成[23-32]，且部分表皮蛋白也參與其中[33-35]。除表皮外，昆蟲的氣管及中腸圍食膜等結構的重要組成成分也為幾丁質[8]。

1.2 海藻糖的合成

從植物到無脊椎動物，海藻糖的合成途徑并不完全相同，現有包括 TPS/TPP（trehalose-6-phosphate synthase/trehalose-6-phosphate phosphatase）、TS（trehalose synthase）、TreY/TreZ（maltooligosyl trehalose synthase/maltooligosyl trehalose trehalohydrolase）、TreP（trehalose phosphorylase）和 TreT（trehalose glycosyltransferring synthase）途徑在內的5種不同的海藻糖合成途徑被廣泛研究[36]。在昆蟲體內，相關研究報道顯示海藻糖主要通過TPS/TPP途徑，即海藻糖合成酶和海藻糖磷酸化酶在脂肪體中合成[6,11]，海藻糖合成酶催化葡萄糖-6-磷酸與 UDP-葡萄糖結合生成海藻糖-6-磷酸，而海藻糖磷酸化酶則負責繼續催化使之脫磷酸化形成海藻糖和磷酸[13,37]，再將海藻糖釋放到血淋巴中，通過淋巴循環輸送到各個組織中發揮功能[14,38-39]。

目前，超過 50種昆蟲的海藻糖合成酶基因被克隆，其包含了TPS和TPP兩個保守的結構域，能夠單獨催化合成海藻糖[13]。2003年，科學家將果蠅的TPS導入人類HEK-293細胞，發現該細胞能夠合成海藻糖并且通過減少蛋白聚集從而提高低氧條件下的存活能力[40-41]。同樣，采用家蠶桿狀病毒系統表達棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的TPS，能夠大量提高海藻糖含量[42]。在某些物種體內已發現TPP[3]，但僅含有TPS一條基因的昆蟲居多。因此，根據這些結果筆者推測昆蟲的海藻糖應該存在兩種不同的合成途徑，一條是通過TPS/TPP途徑來完成；另外一條則是直接通過TPS單獨完成[13]。研究結果顯示，海藻糖合成酶蛋白N-末端的TPS保守結構域能夠催化葡萄糖-6磷脂和 UDP-葡萄糖合成海藻糖-6-磷酸；而C-末端的TPP結構域則催化海藻糖-6-磷酸轉變為海藻糖[43-44]。對此，綜合前人的相關研究，提出了昆蟲海藻糖合成的潛在途徑及與幾丁質合成代謝的關聯圖（圖1）[13]。

圖1 昆蟲海藻糖供給與幾丁質代謝路徑Fig. 1 The pathway of trehalose providing and chitin metabolism in insects[13]

不僅如此，在褐飛虱（Nilaparvata lugens）和德國小蠊（Blattella germanica）中發現和克隆出兩個不同的TPS，分別命名為TPS1和TPS2[11,45]，采用RNAi技術對昆蟲TPS的基因功能研究發現，TPS的表達下降能夠引起昆蟲蛻皮困難，并導致一定的死亡率[11,14,46]。同樣，在 NCBI數據庫中，發現赤擬谷盜（Tribolium castaneum）存在兩個不同的 TPS（XM970683和EFA02222）。隨著基因組測序等技術的發展，在褐飛虱中發現了第3條TPS，且通過序列比對分析發現搖蚊Clunio marinus（CRK87178）與前面兩條TPS蛋白序列相差較大，單獨成一分支，因此命名為TPS3[13,47]。與其他無脊椎動物，如秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）和麥長管蚜（Apelenchus avenae）等物種較為相似，均含有兩條及以上的TPS[48-49]。這些研究意味著昆蟲的海藻糖合成進化途徑更加多樣化，不同昆蟲的海藻糖合成途徑及同一物種中不同的海藻糖合成酶基因的功能需要更加深入的研究和探索。

1.3 海藻糖的水解

海藻糖水解酶又稱海藻糖酶（trehalase，TRE或Treh），最初由Bourquelot于1893年在黑曲霉（Aspergillus niger）中發現，之后發現其廣泛存在于真菌、植物、昆蟲和其他無脊椎動物及脊椎動物中[50]。海藻糖酶可專一地催化一分子海藻糖水解為兩分子葡萄糖，產物用于各種生理及生命活動[24,51-53]，并在昆蟲飛行等行為活動過程中供給能量[54]，另外昆蟲抗逆性適應等各個方面也通過調控海藻糖含量來實現[3,55-56]。

根據昆蟲海藻糖酶的基因特性，其主要分為可溶性海藻糖酶（soluble trehalase，TRE1）和膜結合型海藻糖酶（membrane-bound trehalase，TRE2）兩類[2,57]。1992年，從黃粉蟲（Tenebrio molitor）中提取和分離出昆蟲首個 TRE1，它是一種胞質酶，游離于細胞質之中，負責內源性海藻糖的分解，主要存在于循環系統和消化系統中，如血淋巴、中腸和馬氏管中[58]。膜結合型海藻糖酶被發現和克隆則比較晚，直至 2005年才從家蠶（Bombyx mori）中克隆得到[59]。研究發現TRE2為胞外酶，主要存在于微絨毛或基側膜上，與肌肉中的線粒體結合，負責外源性海藻糖的吸收和同化，在脂肪體、中腸和馬氏管中高表達[5,9,23,50,59-64]。

近年來借助基因組測序技術，采用高通量測序技術進行轉錄組等研究發現昆蟲TRE1不止一條編碼基因存在，如褐飛虱包含TRE1-1和TRE1-2兩條[10,65]，赤擬谷盜有TRE1-1、TRE1-2、TRE1-3和TRE1-4 4條可溶性海藻糖酶基因[18,53]，異色瓢蟲（Harmonia axyridis）中存在 3條或 3條以上的 TRE1[3,66]，其中TRE1已在多種昆蟲中被克隆[5,9,55,59,66-70]。這些研究結果表明在不同昆蟲體內，海藻糖酶基因具有種類多樣性的特點。

1.4 昆蟲幾丁質的合成

昆蟲幾丁質合成途徑包括海藻糖酶和幾丁質合成酶（chitin synthase，CHS）在內的8個基因共同參與，最關鍵且最后一步由幾丁質合成酶完成[23,29,71]。昆蟲的幾丁質合成通路在昆蟲的蛻皮和幾丁質發生中起著重要作用，幾丁質合成酶包括幾丁質合成酶 1（CHS1，又稱 CHSA）和幾丁質合成酶 2（CHS2，又稱CHSB）兩種類型[24-25,72]。CHS1主要負責昆蟲表皮和氣管中幾丁質的合成[9]，除豌豆蚜（Acythosiphon pisum）外已報道的相關昆蟲 CHS1存在可變剪切現象，兩個轉錄子分別為CHS1a和CHS1b[73-74]。另一種是CHS2，只在中腸圍食膜上負責幾丁質的形成[9,75]。

利用 RNAi可探究兩種幾丁質合成酶的作用效果、階段和范圍，比如赤擬谷盜CHS1被RNAi抑制后，出現畸形幼蟲、畸形蛹和畸形成蟲以及蛻皮障礙，畸形蛹中的幾丁質含量降低了66.9%；CHS2被RNAi抑制后，幼蟲取食減少，蟲體變小，中腸中的幾丁質含量降低[23,76]。同樣，當中華稻蝗（Oxya chinensis）的CHS1表達被抑制后，該昆蟲蛻皮時間延遲、不能完成蛻皮或腹部皺縮死亡[25]。而在飛蝗（Locusta migratoria）中，CHS2表達被抑制后，取食量下降，中腸和胃盲囊長度縮短及圍食膜損傷，雌雄死亡率高達 78%[24]。甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）CHS1在RNAi后，昆蟲的生長發育受到抑制，出現蛻皮障礙、表皮幾丁質層不能正常形成、氣管發育畸形等現象[23,72]。最新研究表明褐飛虱體中可能缺乏CHS2，因此CHS1是RNAi的高效目標基因。分別向褐飛虱注射dsCHS1、dsCHS1a和dsCHS1b發現，CHS1和CHS1a的基因干擾會導致褐飛虱翅畸形、細腰、表皮皺縮并最終死亡的現象，dsCHS1b的干擾雖也會導致一定的死亡率，但其他影響不明顯[74]。

2 海藻糖代謝調控幾丁質合成

幾丁質合成的通路始于海藻糖酶（TRE），途經己糖激酶（HK）、葡萄糖-6-磷酸異構酶（G6PI）、果糖-6-磷酸轉氨酶（GFAT）、葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉氨酶（GNPNA）、磷乙酰氨基葡萄糖變位酶（PGM）和 UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶（UAP）后，終于幾丁質合成酶（CHS）[23,77-79]。海藻糖循環路徑位于幾丁質合成路徑的起始端，TPS通過該路徑合成海藻糖，TRE分解海藻糖，為幾丁質的合成提供原料。研究發現海藻糖合成與分解都對昆蟲幾丁質合成有著重要的調控作用，具體見圖1所示。

2.1 海藻糖合成酶與幾丁質調控

海藻糖合成酶（TPS）為海藻糖合成的關鍵酶類，它可以通過調控海藻糖含量的供給平衡，間接調控幾丁質的合成通路中的相關基因表達[11,14]。此外，其對CHS和Cht的表達均存在一定程度的調控作用，調節幾丁質的合成[9,11]。以甜菜夜蛾為研究對象，采用RNAi技術抑制TPS表達后36、48、 60和204 h，其存活率分別為53.95%、49.06%、34.86%和33.24%，顯著低于對照組[14]。

同樣，在褐飛虱體中分別注射dsGFP、dsTPS1和dsTPS2，結果發現注射dsTPS1、dsTPS2后，TPS1與TPS2的轉錄量均減少、海藻糖含量卻在增加，糖原含量顯著降低，幾丁質合成和降解通路中的各個酶活性均受到不同程度的影響[9,11,80]。其中 CHS1和 CHS1a的活性在48 h時抑制、72 h時增強，CHS1b的活性在48 h和72 h時均抑制；除Cht4、Cht9的活性在72 h時增強，其余Cht的活性都在不同程度上受到抑制。同時褐飛虱出現了蛻皮困難、翅畸形和近30%的蟲體死亡率[11]。進而在獲得褐飛虱第 3條海藻糖合成酶后，發現 TPS3的表達被抑制后，絕大多數的幾丁質酶表達顯著下降且伴隨著幾丁質含量的降低[47]，這與赤擬谷盜TPS表達被抑制后幾丁質含量降低的結果一致[46]。而采用RNAi技術抑制馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）TPS表達后，海藻糖含量下降，導致幼蟲和蛹死亡，同時幾丁質含量下降[66]；此外，當柑橘大實蠅（Bactrocera minax）TPS的dsRNA注射到3齡幼蟲時，TPS酶活性和海藻糖含量顯著下降、幾丁質合成途徑中的3個關鍵基因表達被抑制，昆蟲出現畸形并死亡的比例高達52%[81]。

從現有的研究結果來看，當昆蟲單個TPS表達被抑制后，CHS和Cht表達降低，TPS能夠通過調控幾丁質生物合成和降解通路中相關基因的表達，抑制幾丁質的合成并導致昆蟲蛻皮困難、產生畸形和高死亡率[11,66,81]。

2.2 海藻糖水解酶與幾丁質調控

TRE是幾丁質合成通路中的第一個酶，TRE催化海藻糖水解成葡萄糖，葡萄糖接著通過剩余7個酶的催化最終形成幾丁質，TRE在幾丁質合成中的重要性不言而喻。近年來，通過對赤擬谷盜、甜菜夜蛾、褐飛虱、馬鈴薯甲蟲等多種昆蟲的海藻糖酶-幾丁質調控通路的研究，結果均表明TRE對幾丁質的合成與分解存在一定的調控作用[6,9,11,53,66,70]?？扇苄?TRE1和膜結合型TRE2的功能還存在一些差別，TRE1與TRE2調控不同部位的幾丁質合成[23]。利用RNAi技術，注射dsRNA抑制可溶性和膜結合型TRE表達后，昆蟲的存活率都明顯降低，同時在轉錄水平調控幾丁質合成通路的下游基因的表達下調。TRE1的干擾對CHS1（CHSA）影響較大，對CHS2（CHSB）影響很小，因此昆蟲表皮幾丁質的合成受此影響較大；而TRE2對CHS2影響較大，主要影響昆蟲中腸的幾丁質合成[9,75]。

在某些昆蟲中，不同的TRE1也有細微分工。在對赤擬谷盜 5個 TRE進行 RNA干擾的試驗中，TRE1-1、TRE1-2、TRE1-3、TRE1-4和TRE2分別被干擾，觀察到11種畸形表型，5個基因的抑制均導致了不同程度的死亡率，其中TRE1-1和TRE1-3的RNA干擾組中均有大量蟲體因幾丁質合成紊亂而死亡，TRE1-3對CHS1b、TRE2對CHS2存在著調控作用，而 TRE1-1對整個幾丁質合成通路有影響[52]。通過飼喂dsRNA，分別抑制赤擬谷盜TRE1-4和TRE2可導致42%和38%的死亡率[15,53]。在另一種鞘翅目昆蟲馬鈴薯甲蟲的研究中，TRE1α和TRE2表達被抑制后部分幼蟲不能正常化蛹，且出現幼蟲極度脫水，蛻皮困難等不同表型，特別是 TRE1α低表達能夠導致高達80%的死亡率[66]。同樣，抑制灰飛虱（Laodelphax striatellus）TRE1和TRE2可分別導致38.89%和27.72%死亡率[70]。注射dsRNA干擾TRE1和TRE2表達可導致50%以上甜菜夜蛾死亡[9]。這些結果表明，一旦TRE的表達被抑制后，昆蟲的蛻皮過程嚴重受到阻礙，幾丁質含量顯著下降[56]，這也是導致昆蟲死亡的最根本原因。向褐飛虱蟲體注射海藻糖酶抑制劑井岡霉素，48 h后盡管3個TRE和2個TPS的表達均增加，但是2種TRE酶活性顯著下降，GP、CHS1（包括它的2個轉錄子CHS1a和CHS1b）、6個幾丁質酶（Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7 和 Cht9）、HK、G6PI2、GFAT、GNPNA、PAGM1和UAP的表達均減少，同時幾丁質的含量也顯著減少[18]。因此，無論各個TRE具有怎樣的差別，通過注射、飼喂dsTRE干擾TRE或者利用海藻糖酶抑制劑抑制酶活性，都能影響幾丁質的合成和降解，并且造成一定的昆蟲死亡率。

進一步的研究結果表明，干擾TRE表達后不僅阻斷了幾丁質合成，也抑制了幾丁質降解。一方面，干擾TRE后出現了蛻皮困難等現象，這與幾丁質合成酶[72,74,82-83]、幾丁質酶[84]、幾丁質脫乙酰酶[85-86]、β-N-乙酰乙糖胺酶[69]等幾丁質合成和降解通路中相關酶被RNA干擾后的現象十分相似[87]。無論是抑制了TRE還是幾丁質代謝路徑中的其他酶，導致蛻皮困難最重要的原因是幾丁質含量的減少。在褐飛虱幼蟲中注射一定量的有效霉素48 h后幾丁質含量減少了50%[18]，在甜菜夜蛾體中注射dsTRE1和dsTRE2導致表皮幾丁質含量顯著減少，注射dsSeTRE2導致中腸幾丁質含量顯著減少[9]。另一方面，大多數昆蟲的表皮和節肢動物的圍食膜是通過TRE、CHS以及其他6個酶形成的通路來調控的[72,76,83,88-90]，TRE可通過減少幾丁質合成通路中一些關鍵酶的表達來調控幾丁質的合成[9-10]，例如TRE的轉錄和翻譯水平降低可導致 Cht的表達減少，從而導致蛻皮困難和較高的死亡率[18]。TRE1和TRE2可調控CHS1和CHS2[9]，在褐飛虱中CHS1、CHS1a和CHS1b均在TRE調控下表達下調[10]，并且同時注射3種dsTRE后己糖激酶（HK）、果糖-6-磷酸轉氨酶（GFAT）、葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉氨酶（GNPNA）、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶（UAP）和多個幾丁質酶的含量顯著下降[10]。

綜上所述，當TRE表達或TRE酶活性被抑制時，大多數昆蟲發育出現翅發育畸形、蛻皮困難、體重減輕、幾丁質合成減少、生長受阻、飛行減少甚至死亡的現象[6,91]。TRE的低表達打破幾丁質代謝平衡可能是導致昆蟲蛻皮困難乃至死亡的最根本原因。

3 結論與展望

IWASA等[92]于1970年從某種鏈霉菌中分離得到一種海藻糖酶抑制劑有效霉素 A（又稱井岡霉素，validamycin）。1987年，研究表明其有效成分是糖苷配基的有效胺（validoxylamine A，VAA）[93-94]，它與海藻糖的構造非常相似，但和海藻糖酶的親和力更強，因此 VAA可通過與海藻糖“爭奪”海藻糖酶來實現對海藻糖酶的抑制作用，從而對昆蟲產生各種影響[95-96]。最新研究發現，海藻糖酶抑制劑validamycin能夠同時抑制TRE1和TRE2的蛋白活性，并通過抑制幾丁質合成酶及幾丁質酶在 mRNA水平上的表達，從而降低幾丁質含量引起昆蟲蛻皮困難并大量死亡[18]。從菌類、植物等提取出的海藻糖酶抑制劑除有效霉素A外、還有Trehazolin、Salbostatin、植物堿、Suidatrestin等，它們在不同程度上抑制海藻糖的水解[84,97-98]。昆蟲中海藻糖的水解與昆蟲的生理活動息息相關，若體內海藻糖的分解路徑被阻斷，將會影響昆蟲變態發育、生殖和飛行等正常生理活動[96]。海藻糖代謝與幾丁質合成具有緊密聯系，并且兩者均在昆蟲體內具有舉足輕重的作用。更為重要的是海藻糖合成在脊椎動物，特別是哺乳動物中缺失，具有成為潛在安全性害蟲控制靶標途徑的潛能[12]。已有研究發現化合物 4-取代的 2,6-二氨基-3,5-二氰基-4H-噻喃（英文名：4-substituted 2,6-diamino-3,5-dicyano-4H-thiopyrans）能夠抑制TPS的活性，具有作為殺蟲劑的潛能[17]。而且TPP被認為將來在抗細菌、抗真菌和抗寄生蟲藥物的研發中具有很大的潛力[99]。目前對TRE和TPS幾丁質調控的研究證明，它們在昆蟲體內的幾丁質通路中起著重要的作用，通過RNA干擾TRE1、TRE2及TPS都可導致蟲體不同程度的畸形和死亡。

昆蟲海藻糖合代謝途徑相關基因的進化途徑及功能仍存在許多未被研究清楚的問題。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的昆蟲基因組測序完成，某些昆蟲發現了2個及以上的TPS，甚至5個以上的TRE，這些相同家族的基因除了具有共同的功能外，也可能存在組織間表達的差異性或者功能上的差異?？扇苄訲RE1進化的多樣性到底是從單個到多個，或是多個進化到多個？同物種不同的TRE1功能差異性又如何？可溶性還是膜結合型TRE具有更好的調控海藻糖降解能力，哪個更加適合作為害蟲控制的靶標基因？此外，昆蟲海藻糖合成途徑還有待進一步的深入研究，TPS的多樣性和TPP的功能研究同樣值得期待。當然，從植物害蟲生物防治的角度出發，繼續深入研究不同的海藻糖代謝途徑基因對幾丁質合成及降解的調控功能，有助于推動以海藻糖代謝途徑相關酶基因為靶標的綠色農藥開發，為今后海藻糖酶抑制劑及海藻糖合成酶抑制劑等綠色農藥的開發提供理論依據。

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