玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮形態(tài)學及熱應激蛋白70分布和表達的影響

周敏，周雪梅，楊立杰，黃麗波，馮蕾，邵明慧，楊晨，楊維仁，楊在賓，姜淑貞

（山東農業(yè)大學動物科技學院/山東省動物工程與疾病防治重點實驗室，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）主要是由多種鐮刀菌種產生的具有雌激素活性的代謝產物[1-4]。近年來，國內外眾多地區(qū)谷類作物及其加工副產品均不同程度地受到 ZEA的污染[4-6]。飼喂ZEA污染的飼糧引起動物食欲降低、繁殖機能障礙、心臟和肝臟受損等事件屢見不鮮[7-8]，深層次探究ZEA的毒性機制愈發(fā)刻不容緩。【前人研究進展】研究表明，飼糧50—100 mg·kg-1的 ZEA會引起母豬外陰發(fā)炎紅腫、陰道和直腸脫落、卵巢畸形、假孕、不孕和流產等癥狀[9]。飼糧中添加 1.1、2.0、3.2 mg·kg-1的ZEA增加仔豬生殖器官指數(shù)，刺激陰戶腫脹，使子宮和卵巢組織結構發(fā)生改變[10]。戴美玲等[11]證實 ZEA（1.04 mg·kg-1）通過調控卵巢中生長激素受體（GHR）和增殖細胞核抗原（PCNA）的高水平表達誘導斷奶小母豬卵巢提前發(fā)育。STOPA等[12]研究發(fā)現(xiàn)ZEA（50、75 μg·kg-1）及其代謝產物能引起母狗子宮粘膜細胞凋亡增多。BOUAZIZ 等[13]證實 ZEA（10 μg·mL-1）通過調控雌二醇、黃體酮和鈣等多個信號通路影響精子的能動性，繼而影響人生殖器官的發(fā)育和生殖功能。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）是動物機體在應激狀態(tài)下迅速合成的一種高度保守的蛋白[14-17]，能夠減輕應激對機體的損傷[18]。應激狀態(tài)下，機體內的免疫細胞最先接受刺激信號，激發(fā)免疫功能，應激誘導產生的 HSPs積極參與免疫細胞的發(fā)育和激活，保證免疫應答的正常進行[19-22]。冷波等[23]證實飼糧 1.04 mg·kg-1的 ZEA 上調斷奶小母豬小腸 HSP70的表達量。【本研究切入點】有關ZEA對動物機體毒性機理的研究大多是在離體條件下進行的，且低劑量ZEA（0.5—1.5 mg·kg-1）對斷奶小母豬子宮內細胞因子 HSP70的陽性分布規(guī)律和表達量的影響尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗選擇斷奶小母豬為試驗動物，以熱應激蛋白家族中含量最多的HSP70為研究對象，探索低劑量ZEA（0.5—1.5 mg·kg-1）對斷奶小母豬子宮形態(tài)結構及熱應激反應的影響，為進一步探究 ZEA誘導子宮異常發(fā)育的毒性作用機制以及ZEA對斷奶小母豬子宮損傷及抗損傷作用機制提供參考依據(jù)，以期為生豬生產中防治ZEA的毒性作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

動物飼養(yǎng)試驗于2016年4—6月在山東農業(yè)大學畜牧科技園進行。

1.1 試驗材料

玉米赤霉烯酮（ZEA），購于以色列 Fermentek（Jerusalem，Israel）公司，色譜純，純度保證值為98%。

表1 基礎飼糧組成和營養(yǎng)水平（風干基礎）1)Table 1 Ingredients and nutrient levels of the basal diet (air dry basis)

1.2 試驗設計與飼糧

1.2.1 試驗設計 選擇25—28日齡健康的三元（杜×長×大）雜交斷奶雌性仔豬40頭。在產床上繼續(xù)飼養(yǎng)10 d，然后轉入試驗籠（0.48 m2）。根據(jù)日齡（35—38）和平均體重（14.01 ± 0.86 kg）分成4個處理，每個處理10頭，組間初始體重差異不顯著（P＞0.05）。斷奶小母豬基礎飼糧參考NRC（2012）營養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。對照組飼喂基礎飼糧（Control），處理 1、2和3組分別在基礎飼糧基礎上添加 0.5（ZEA0.5）、1.0（ZEA1.0）和 1.5（ZEA1.5）mg·kg-1ZEA。仔豬在裝有塑料漏縫地板、乳頭飲水器和料槽的單體籠內飼養(yǎng)，自由采食和飲水。試驗開始前對豬舍及周圍的環(huán)境進行全面清掃、消毒，試驗過程豬舍每周進行一次常規(guī)消毒。舍內安裝紅外保溫燈，第一周維持舍內溫度在30 ℃左右，之后溫度維持在26—28 ℃左右。豬舍相對濕度為 65%左右。預飼期10 d，正式期35 d。仔豬管理和免疫按常規(guī)進行。試驗結束后仔豬全部屠宰。

1.2.2 玉米赤霉烯酮污染飼糧的配制 用乙酸乙酯將色譜純度（98%）晶體粉末狀ZEA溶解，將制成的溶液噴灑到一定量的滑石粉載體上，揉搓至充分混合，放置過夜使乙酸乙酯充分揮發(fā)，制成1 000 mg·kg-1的ZEA預混劑，然后用不含毒素的玉米粉將 1 000mg·kg-1的ZEA預混劑稀釋成10 mg·kg-1的ZEA預混劑，最后根據(jù)各處理飼糧中ZEA的設計水平，用ZEA預混劑替代配方中的玉米和載體配制成試驗飼糧，儲存在密封容器中。試驗飼糧需要在試驗正式開始前一周一次性配合完成，在試驗前和試驗結束后分別取樣后，立即進行飼糧中養(yǎng)分含量和毒素水平檢測。取樣方法按照《飼料采樣方法》（GB/T 14699.1-93）。

1.2.3 飼糧常規(guī)養(yǎng)分和毒素的測定 飼糧常規(guī)養(yǎng)分測定參考AOAC（2012）的方法進行。粗蛋白用凱氏定氮法；鈣根據(jù)高錳酸鉀滴定法測定；磷根據(jù)鉬黃比色法測定；氮基酸用日立835-50氮基酸自動分析儀進行測定。

飼糧中ZEA、嘔吐毒素、黃曲霉毒素和煙曲霉毒素測定委托青島出入境檢測檢疫局測定。采用免疫親和柱層析凈化，以液相色譜法熒光檢測器測定ZEA和黃曲霉毒素的含量，外標法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜－串聯(lián)質譜法，以液相色譜結合紫外檢測器測定煙曲霉毒素和嘔吐毒素的含量，外標法定量。黃曲霉毒素、ZEA、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的最低檢測限分別為 1.0 μg·kg-1、0.1、0.1 和 0.25 mg·kg-1。ZEA的實際測定值分別為0、0.52 ± 0.07、1.04 ± 0.03和1.51 ± 0.13 mg·kg-1，兩次均未檢測到其他毒素或者低于檢測限水平。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 樣品采集 飼養(yǎng)試驗結束前一天禁食12 h，空腹稱重后將全部動物屠宰。剖開腹腔和胸腔，對生殖器官進行肉眼觀察，記錄病變情況，迅速取出兩份子宮，去除周圍的脂肪組織，觀察、測量并稱重，一份置于2 mL無RNA酶的凍存管中置液氮中速凍，而后-80℃保存，用于檢測HSP70的mRNA相對表達量；另一份放于 Bouin’s液中固定，用于檢測子宮形態(tài)學的結構和HSP70的陽性分布規(guī)律。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色（H.E.染色法） 將Bouin’s液中固定好的子宮組織進行切割修整，放于流水中沖洗至組織原色，經乙醇逐級脫水，經二甲苯透明，采用 BMJ23型包埋機進行包埋。用切片機（LEICA RM2235，Germany）進行切片，片厚5—6 um。切片依次經二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水至蒸餾水。蘇木素染色6 min；在鹽酸酒精中分化，藍化15—20 min；伊紅染色 1 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Nikon ELIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡（日本）觀察子宮的形態(tài)學結構并拍照。

1.3.3 免疫組織化學法（超敏二步法） （1）石蠟切片經常規(guī)脫蠟至水；（2）檸檬酸緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 6.0）進行抗原熱修復，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（0.01mol·L-1，pH 7.2）沖洗 5 min×3（下同）；（3）10%H2O237℃避光孵育1 h，PBS洗3次；（4）10%山羊血清37℃封閉孵育1 h；（5）加鼠抗HSP70（1:50）單克隆抗體（BM0368，武漢博士德生物工程有限公司），4℃過夜孵育；（6）37℃復溫，PBS洗3次；（7）二抗為抗鼠 Polink-2 plus? 超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-9002，北京中杉金橋生物技術有限公司）（8）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（TIANGEN coad：PA110，Lot：P4819）顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，控制顯色時間；（9）蘇木素復染，分色、脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下明亮視野觀察免疫陽性細胞分布規(guī)律，拍照、留存。

1.3.4 子宮熱應激蛋白70（HSP70）的累積光密度值（IOD）測定 用Nikon ELIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡（日本）觀察子宮組織切片。每頭豬子宮切片隔10張切片取1張，共取5張。使用Image Pro-Plus 6.0軟件統(tǒng)計分析子宮切片橫斷面IOD。

1.3.5 熱應激蛋白70（HSP70）mRNA相對表達量的測定 根據(jù)Genbank已報道的豬的HSP70和GAPDH基因序列，利用Primer 6.0軟件設計相應引物，并由華大基因合成（表2）。

取 50—70 mg -80℃保存的子宮樣品，按 Trizol法提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測其純度及濃度，吸光度(OD) 比值保持在 1.8—2.0之間。按照PrimeScript PMRT Master Mix反轉錄試劑盒（RR036A，Applied TaKaRa，大連）說明書進行操作，反應體積為20μL。

qRT-PCR的反應體系體積為20 uL，按照SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（Takara coad：RR420A，Lot：AK7502）試劑盒說明進行操作，每個樣品設置三個重復。使用ABI 7 500 Realtime熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性 5 s，60℃退火延伸 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，循環(huán)次數(shù)為43。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用 2-ΔΔCt對熒光定量 PCR檢測結果進行數(shù)據(jù)處理，對HSP70基因 mRNA在子宮中的相對表達量進行分析。數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行單因子方差（One-Way ANOVA）分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著。采用IPP 6.0圖像分析軟件，對子宮HSP70的累積光密度（IOD）進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮形態(tài)學結構的影響

飼糧中添加不同水平 ZEA對斷奶小母豬子宮形態(tài)學的影響見圖 1。分析表明，對照組子宮肌層及內膜較薄（A1），子宮腺分布分散且密度小（A2）；隨著飼糧中ZEA水平的升高，子宮肌層厚度（B1、C1和D1的黑色箭頭）和內膜厚度（B1、C1和D1的黃色箭頭）明顯增厚，子宮腺數(shù)量顯著增多，密度明顯增大。隨著飼糧中ZEA水平的升高，子宮肌層及內膜厚度呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.001）線性升高（表 3）；與對照組相比，0.5、1.0和 1.5 mg·kg-1ZEA處理的子宮肌層及內膜厚度顯著增加（P＜0.05）；3個ZEA處理組相比，1.5 mg·kg-1處理的子宮肌層和內膜厚度顯著高于1.0 mg·kg-1處理（P＜0.05），而1.0 mg·kg-1處理的子宮肌層和內膜厚度又顯著高于 0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05）。

表2 HSP70和GAPDH的基因引物序列Table 2 Primer sequences of HSP70 and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）

圖1 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮形態(tài)學結構的影響Fig. 1 Effects of zearalenone on photomicrographs of hematoxylin and eosin stained uterus of post-weaning gilts

2.2 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮熱應激蛋白 70（HSP70）分布的影響

飼糧中添加不同水平 ZEA對斷奶小母豬子宮HSP70分布的影響見圖2。免疫組化結果顯示斷奶小母豬子宮中的HSP70陽性細胞主要分布在肌層平滑肌細胞、腔上皮細胞、子宮腺上皮細胞和血管內皮細胞內，陽性反應物質呈黃色和棕黃色，胞質著色，偶見胞核著色。對照組中子宮肌層平滑肌細胞、子宮腺上皮細胞、腔上皮細胞和血管上皮細胞免疫陽性分布較弱，HSP70陽性呈淡黃色均勻分布；ZEA處理組的HSP70免疫陽性物質分布規(guī)律與對照組基本一致（紅色箭頭），但隨著飼糧中 ZEA水平的升高，HSP70免疫陽性反應逐漸增強，陽性物質著色加深。HSP70累積光密度（IOD）結果（表4）表明，隨著飼糧中ZEA水平的升高，斷奶小母豬子宮中肌層、腺上皮、腔上皮及總 HSP70免疫陽性物質的 IOD均呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.05）線性升高；總體上，1.5 mg·kg-1處理的子宮 HSP70免疫陽性物質的 IOD顯著高于 0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05），0.5和 1.0 mg·kg-1處理的子宮HSP70免疫陽性物質的IOD又顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，1.5 mg·kg-1處理的子宮肌層 IOD 顯著高于 1.0 mg·kg-1處理（P＜0.05），1.0 mg·kg-1處理的子宮肌層 IOD 又顯著高于 0.5 mg·kg-1處理和對照組（P＜0.05）；1.0和1.5 mg·kg-1處理的子宮腔上皮IOD顯著高于0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05），0.5 mg·kg-1處理的子宮腔上皮IOD又顯著高于對照組（P＜0.05）；1.5 mg·kg-1處理的子宮腺上皮IOD顯著高于 1.0 mg·kg-1處理（P＜0.05），1.0 mg·kg-1處理的子宮腺上皮IOD顯著高于0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05），0.5 mg·kg-1處理的子宮腺上皮IOD又顯著高于對照組（P＜0.05）。

表3 ZEA對斷奶小母豬子宮肌層和內膜厚度（40倍鏡下測量）的影響Table 3 Effects of zearalenone on myometrial and endometrial thickness measured in 40 times of uterus in postweaning piglets

圖2 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮HSP70分布的影響Fig. 2 Effects of zearalenone on the HSP70 distribution in the uterus of post-weaning gilts

表4 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮不同部位HSP70陽性反應的累積光密度的影響Table 4 The effects of zearalenone on the immunoreactive integrated optic density (IOD) of HSP70 in the different parts of the uterus in post-weaning gilts（×103）

2.3 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮熱應激蛋白 70（HSP70）的mRNA相對表達量的影響

熱應激蛋白 70（HSP70）的 mRNA相對表達量與免疫組化結果顯示的免疫陽性一致（圖 3）。隨著飼糧 ZEA水平的升高，斷奶小母豬子宮 HSP70的mRNA 相對表達量呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.001）線性升高。與對照組相比，0.5、1.0 和 1.5 mg·kg-1ZEA處理的子宮HSP70的mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；3個ZEA處理組相比，1.5 mg·kg-1處理的子宮HSP70的mRNA相對表達量顯著高于0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05）。

3 討論

國內外關于 ZEA毒性的研究大多是利用已知ZEA含量的天然污染飼糧進行的[24]，但是天然污染飼糧中其它毒素會帶來一定的干擾。本試驗選擇高純度的ZEA添加到飼糧，在筆者前期研究結果的基礎上[10,25-30]，進一步探索低劑量ZEA（0—1.5 mg·kg-1）對斷奶小母豬子宮形態(tài)學及子宮 HSP70分布和mRNA相對表達量的影響。

圖3 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮HSP70的mRNA相對表達量的影響Fig. 3 Effects of zearalenone on relative mRNA expression of HSP70 in the uterus of post-weaning gilts

本試驗條件下，飼糧中添加0.5—1.5 mg·kg-1ZEA對小母豬的平均日采食量、平均日增重和料重比均沒有顯著影響[31]，關于ZEA水平對動物生長性能的機理研究，還需要進一步的研究證實。

3.1 對斷奶小母豬子宮形態(tài)學的影響

玉米赤霉烯酮具有類雌激素的作用，其作用的靶器官主要是雌性動物的生殖系統(tǒng)。ZEA能與雌激素受體結合，誘發(fā)母豬雌激素過多癥，典型的癥狀為陰戶濕腫、陰道脫垂、子宮增生及乳腺增大等[32]。ZEA和α-玉米吃霉烯醇（α-ZOL）都能夠競爭性結合 17β-雌二醇，誘導雌激素過多癥，隨后激活基因表達，提高細胞核內RNA聚合酶的活性，RNA合成增加，提高相關蛋白質的合成，引起生殖器官的功能和形態(tài)變化[33-35]。先前有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加ZEA（0.5、2.0 mg·kg-1）可增加后備母豬的子宮重量和陰戶寬度，同時這一趨勢與子宮粘膜肌層變厚、腺體增生等形態(tài)變化相一致[36]。類似地，飼糧中添加ZEA（1.1、2.0、3.2 mg·kg-1）可引起斷奶小母豬子宮肌層平滑肌增生且具有劑量依賴特性，這一結果與子宮重量以及生殖器官指數(shù)的增大相一致[30]。近期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加 1.04 mg·kg-1能顯著增加生殖器官的相對重量，并且通過調控卵巢中GHR和PCNA的高水平表達促使斷奶仔豬卵巢提前發(fā)育[11]。綜上所述，推測玉米赤霉烯酮誘導豬子宮肥大與形態(tài)學變化基本一致。0.5—1.5 mg·kg-1對斷奶小母豬子宮形態(tài)學結構的影響尚未見報道，本試驗 H.E.染色結果表明，子宮內膜和肌層的厚度隨ZEA濃度的增加顯著增厚，子宮腺體密度增大，表明 ZEA（0.5—1.5 mg·kg-1）在一定程度上對試驗小母豬生殖器官產生毒害作用，這與前人的研究結果相一致。盡管ZEA誘導母豬子宮肥大得到研究證實，但對其作用機制的研究還需要更深層次的研究。

3.2 玉米赤霉烯酮對斷奶小母豬子宮熱應激蛋白 70（HSP70）表達的影響

關于ZEA引起動物機體的氧化應激已得到證實。ABID-ESSEFI等[37]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA（10、20、40μmol·L-1）能降低細胞活性，抑制蛋白質和DNA生成，丙二醛（MDA）含量提高，細胞結構受損，引起應激反應。2.0和3.2 mg·kg-1ZEA引起斷奶小母豬肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧物酶（GSH-PX）活性下降，MDA明顯上升，造成肝臟氧化損傷，證實氧化應激是ZEA代謝產物毒性的又一機制[30]。ZEA顯著提高大鼠血漿葡萄糖、乳酸、N-乙酰基糖蛋白、O-乙酰基糖蛋白和丙酸的水平，顯著降低血漿絡氨酸、支鏈氨基酸、膽堿的水平，提示ZEA具有強氧化作用[38]。因此，推測ZEA對動物機體造成一定程度的損傷作用。熱應激蛋白70（HSP70）是HSP家族中最重要的蛋白，分布在各種細胞中，并具有廣泛的細胞保護作用，對于生物體抵抗和適應不良環(huán)境有著十分重要的意義[39-41]。報道表明，熱應激蛋白除了因熱休克刺激產生外，氧化性損傷、重金屬、亞砷酸鈉、氨基酸類似物等都可以誘導其高水平表達[23]。本研究免疫組化及 mRNA相對表達量結果顯示，隨著飼糧中ZEA水平的升高，HSP70免疫陽性反應明顯增強，并且檢測到mRNA相對表達量顯著升高，表明ZEA對小母豬子宮產生了一定程度的毒害作用，從而導致子宮為了抵抗毒素的應激而高表達HSP70，以減輕毒素應激帶來的損傷[23]。盡管HSP70的分子伴侶功能、抗細胞凋亡作用、抗氧化作用、參與細胞耐熱和細胞保護等作用被大多數(shù)學者認同，但是HSP70對動物機體的作用機制及其和氧化應激與生殖毒性的相關性還需要更深入、全面的研究。

4 結論

本試驗條件下，0.5 mg·kg-1及其以上水平的玉米赤霉烯酮可顯著改變斷奶小母豬子宮形態(tài)學結構，增強子宮熱應激蛋白70免疫陽性物質分布（IOD），上調熱應激蛋白 70的 mRNA相對表達量，提示 0.5 mg·kg-1玉米赤霉烯酮足以誘導子宮組織形態(tài)學結構和應激反應，對生殖器官造成損傷，通過調控子宮內熱應激蛋白 70高水平表達可以抵抗玉米赤霉烯酮對子宮細胞的損傷。

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