豫芝11號種子發育過程中蛋白質及其組分的變化規律

韓亞飛，汪學德，鄭永戰，梅鴻獻，魏安池，劉艷陽

（1河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001；2河南省農業科學院芝麻研究中心，鄭州 450008）

0 引言

【研究意義】芝麻種子中一般含有18%—22%蛋白質，是芝麻種子重要組成部分。目前芝麻餅粕研究應用較多，但芝麻蛋白作為營養強化劑在食品領域的應用有待進一步加強[1-2]；芝麻蛋白質中必需氨基酸含量豐富，除賴氨酸含量較低，其他必需氨基酸均達到 FAO/WHO規定[3]。對芝麻蛋白質及組分的變化規律進行研究，比較不同試驗點蛋白質含量和組分的差異性，分析蛋白質相對分子質量變化規律以及氨基酸組成變化，對芝麻品質育種及其蛋白質的開發利用具有重要意義。【前人研究進展】張秀榮等[4]通過對中芝11研究發現種子中粗蛋白在種子發育15 d以前就達到一定水平，隨后緩慢增加。甄志高等[5]研究了氣象條件對夏芝麻蛋白質和脂肪酸含量的影響，通過對2000—2002年全國芝麻區試品系的粗蛋白和粗脂肪含量測定分析，發現溫度是影響蛋白質的主導因子。芝麻種子中蛋白質按照其溶解度可以分為白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6-7]。蛋白質組分的動態變化規律研究已有報道[8-10]，成熟芝麻種子中白蛋白占8.6%、球蛋白占67.3%、醇溶蛋白占1.3%、谷蛋白占6.9%[11]，但是種子發育過程中的蛋白質組分變化尚未見報道。世界糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）在1973年提出了蛋白質營養價值評價方法——必需氨基酸比值系數法[12]。HA 等[13]研究了芝麻種子萌發過程中氨基酸變化，發現隨著萌發過程的延長，氨基酸含量顯著上升。但是關于芝麻種子發育過程中的氨基酸變化規律并未見報道。【本研究切入點】雖然對生長過程中芝麻蛋白質含量已有研究，但一般局限在生長過程中蛋白質累積變化，對生長過程中四種芝麻蛋白質組成變化并未涉及，而芝麻生長過程中蛋白質分子量和氨基酸組成變化對芝麻蛋白利用具有重要作用。【擬解決的關鍵問題】明確種子發育時間和環境對芝麻種子蛋白質組分、蛋白質相對分子質量和氨基酸組成及積累特征的影響，以期為芝麻高蛋白遺傳改良和芝麻蛋白質的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 分析儀器及試劑

電泳儀ESP-300：上海天能電儀廠；FOSS全自動凱氏定氮儀Kjeltec8400：福斯分析儀器公司；離心機LD5-10：北京京力離心機有限公司；LGJ-18真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；塞卡姆氨基酸分析儀：德國塞卡姆公司；低分子量標準蛋白質：北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；其他試驗試劑均采用分析純。

1.2 材料準備

試驗材料豫芝 11號由河南農業科學院芝麻研究中心提供，于 2016年6月 11號在周口（33.64°N，114.72°E）、南陽（33.01°N，112.53°E）和駐馬店（32.95°N，113.97°E）3個試驗點同期播種。于盛花初期在試驗田中隨機選取當日盛開的花朵進行標記，一次性標記5 000朵并記錄標記日期。芝麻開花授粉后第10天開始取蒴，此后每5 d取樣一次至芝麻成熟。帶蒴樣品保存在-40℃條件下，待取樣批次結束后統一去殼、冷凍干燥后儲藏備用。

1.3 蛋白質含量測定

樣品的粗蛋白含量按照 GB50095-2010食品中蛋白質的測定方法進行測定；不同組分蛋白質含量的測定參照Osboren蛋白分類方法進行測定[14]。

1.3.1 清蛋白組分 稱取1.0000 g脫脂芝麻，料液比1∶15，在常溫下攪拌萃取20 min，經4 000 r/min離心10 min后將上清液轉移至50 mL容量瓶中，重復2次，定容，用快速濾紙過濾，棄去最初濾液，移取10 mL濾液進行蛋白質含量分析。

1.3.2 球蛋白組分 按料液比 1∶10向除去清蛋白組分的沉淀中加入5% NaCl溶液，在常溫下攪拌30min，經離心后轉移至50 mL容量瓶，重復上述操作2次，定容。經過濾后測定球蛋白含量。

1.3.3 醇溶蛋白組分 按料液比 1∶15向除去清蛋白組分和球蛋白組分的沉淀中加入 70%乙醇，在 60℃水浴中攪拌60 min，離心，50 mL容量瓶定容，過濾后測定醇溶蛋白質含量。

1.3.4 谷蛋白組分 按照料液比 1∶10向除去清蛋白組分、球蛋白組分和醇溶蛋白組分的沉淀中加入0.2%NaOH溶液，在常溫下攪拌40 min，離心，50 mL容量瓶定容，測定谷蛋白含量。

1.4 SDS-PAGE凝膠電泳

參照郭堯君[15]SDS-PAGE不連續凝膠制備方法進行制備，根據分離要求，配制分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%。濃縮膠過程電壓100 V，分離膠過程電壓120 V。

1.5 芝麻氨基酸組成分析

評價蛋白質品質一般包括氨基酸種類，數量和含量。按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》和NY/T57-1987《谷物籽粒色氨酸測定法》方法測定脫脂芝麻蛋白粕中的氨基酸組成。氨基酸平衡理論以FAO/WHO的必需氨基酸標準模式，按照公式計算必需氨基酸比值，氨基酸的主要參數有：

氨基酸比值（RAA）=芝麻蛋白某種氨基酸/標準模式中氨基酸含量；

氨基酸比值系數（RC）=氨基酸比值/氨基酸比值平均數。

如果食物中氨基酸含量與標準模式相同，則氨基酸比值系數為1，大于1表示該氨基酸含量過量，小于 1表示該氨基酸含量不足；RC最小表示該氨基酸為此食物中的第一限制性氨基酸。

氨基酸比值系數分：SRC=100-CV×100

式中，CV為變異系數，CV=標準差/均數，SRC越大，表示蛋白質樣品越接近標準模式，其營養價值越高。

2 結果

2.1 芝麻種子粗蛋白質含量及其組分的變化

發育過程中的芝麻種子粗蛋白的含量如圖 1所示，芝麻授粉后10—20 d，種子中蛋白質含量增加較快，從 9.83%增加到 17.47%，增加率為 77.72%，20—35 d緩慢增加，從17.47%增加到20.86%，增加率為19.43%；35—40 d變化不大，3個試驗點趨勢相似。周口試驗點芝麻粗蛋白含量從15 d開始顯著低于南陽和駐馬店試驗點，這種趨勢直至芝麻成熟。從測定節點看，周口試驗點10—30 d內蛋白質含量差異性顯著，30—40 d無顯著差異；南陽和駐馬店試驗點除20 d和35—40 d南陽試驗點蛋白質含量顯著低于駐馬店試驗點，其他取樣節點不存在顯著性差異。周口試驗點在授粉后30 d左右達到最大，此后保持穩定；而南陽和駐馬店試驗點35 d積累量最高，此后保持穩定。

圖1 3個試驗點豫芝11種子發育過程中的蛋白質含量積累特征Fig. 1 Accumulation characteristics of Yuzhi11 sesame protein content of growth period in three test areas

從表1和圖2中清蛋白組分可以看出，豫芝11號種子發育過程中清蛋白含量并非一直上升，與芝麻粗蛋白含量變化規律不同。其中，20 d含量達到最大，此后下降，30 d與10 d的蛋白質含量接近，30—40 d雖略有上升，但較平緩。周口試驗點芝麻種子中清蛋白含量在授粉后10 d與南陽和駐馬店兩個試驗點無顯著差異性，授粉后15—25 d，周口試驗點清蛋白積累量顯著低于其他試驗點，此時種子中清蛋白積累量降低，清蛋白含量在授粉后30 d時達到最低，隨后清蛋白含量緩慢升高；3個試驗點清蛋白累積含量無顯著性差異，說明環境對清蛋白含量累積無顯著影響，但環境因素能夠造成芝麻生長過程中清蛋白含量變化。球蛋白含量隨種子發育進程逐漸上升，其變化規律與粗蛋白含量變化一致。在4種蛋白組分中球蛋白含量增加最多，從1.37%增加到31.73%，授粉后30 d，球蛋白含量達到最大，占芝麻脫脂蛋白的50%以上，醇溶蛋白和谷蛋白含量在芝麻整個生長過程中呈現出波動狀態。

表1 3個試驗點豫芝11種子發育過程中4種蛋白質組分積累特征Table 1 Accumulation characteristics of Yuzhi11 sesame protein component of growth period in three test areas

2.2 SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖3中A，B和C分別表示周口、南陽和駐馬店3個試驗點豫芝11號種子不同發育時間的蛋白質凝膠電泳圖譜。從圖中可以看出，芝麻授粉后10 d，第一泳道上在20 kD和31 kD處出現模糊條帶，此時蛋白質含量約9.78%；授粉后15 d，芝麻蛋白質在20 kD和31 kD處積聚較快，同時37 kD、55 kD處蛋白質大分子開始合成；隨著發育時間的延長，種子中大分子蛋白質含量逐漸增加，與授粉后15 d后相比，授粉20 d后種子中20 kD、31 kD蛋白大分子增加量明顯，在55 kD處蛋白大分子種類增多，授粉25—30 d，37 kD處蛋白分子逐漸消失，同時55 kD處蛋白質大分子持續增加。據此可推測，隨著種子的發育小分子蛋白質逐漸合成大分子蛋白質，授粉35 d，芝麻種子中存在的蛋白質分子量主要分布在20 kD、31 kD和55 kD處，且20 kD和31 kD處蛋白質含量豐富。

2.3 氨基酸組成的變化

圖2 不同地點種子發育過程中蛋白含量Fig. 2 Protein content of different areas and growth period

圖3 不同地點及生長發育期凝膠電泳圖Fig. 3 Gel electrophoresis figures of different areas and growth period

表2 不同試驗點的豫芝11 號種子發育過程中氨基酸組成Table 2 Compose of amino acid of Yuzhi11 sesame of growth period in three test areas (%)

從表2可以看出，豫芝11號種子中檢測出17種氨基酸，其中含有8種必需氨基酸（蘇氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）。氨基酸含量在發育過程中呈現出逐漸增加趨勢，谷氨酸和精氨酸是含量最多的兩種氨基酸，分別占總氨基酸25.52%和19.32%。賴氨酸含量呈現出先升高后降低的趨勢，在20 d時賴氨酸含量達到最大，此時芝麻清蛋白含量最大。蛋氨酸等含硫氨基酸的存在，降低了芝麻蛋白的水溶性。周口、南陽和駐馬店3個試驗點芝麻種子蛋白質中的必需氨基酸占總氨基酸含量隨著種子發育時間的延長呈下降趨勢，周口試驗點必需氨基酸占總氨基酸含量從42.29%下降至35.28%，南陽和駐馬店試驗點從40.03%下降至32.60%。

表3 不同試驗點的豫芝11號種子發育過程中氨基酸系數及氨基酸比值系數分Table 3 Ratio coefficient and score of ratio coefficient of Yuzhi11 sesame protein of growth period in three test areas

從表 3可以看出，人體必需的氨基酸纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸的比值系數大于 1，含量豐富。第一限制性氨基酸隨生長時間延長而變化，在授粉10 d和15—20 d，第一限制氨基酸分別為甲硫氨酸和色氨酸，25—30 d蛋白質的第一限制性氨基酸為蘇氨酸，芝麻授粉35 d，蛋白質第一限制氨基酸為賴氨酸。在種子發育過程中，賴氨酸的比值系數從1.10減少至0.51，與其他氨基酸比值系數變化趨勢表現出顯著差異性；從氨基酸比值系數分可以看出，芝麻蛋白評分較低，與標準模式下氨基酸組成差別較大。3個試驗點芝麻蛋白質氨基酸比值系數分均呈現先升高后降低的趨勢，在授粉后25 d氨基酸比值系數分達到最大。周口試驗點氨基酸評分顯著低于南陽和駐馬店兩個試驗點，主要是由于周口試驗點蘇氨酸評分顯著低于南陽和駐馬店地區。

3 討論

芝麻種子發育過程中蛋白質含量變化呈現出先升后平穩的趨勢，這與其他油料作物（如大豆和蓖麻籽）蛋白質積累規律一致[16-17]。芝麻授粉15—40 d，周口試驗點芝麻蛋白質含量顯著低于南陽和駐馬店試驗點，這與前人研究發現芝麻蛋白含量隨緯度升高而降低的結果一致[18-19]；芝麻種子中蛋白質含量在授粉后35 d達到最大，這與CHUNG[20]、胡華麗等[21]研究結果一致。芝麻種子中清蛋白含量在生長發育時期呈現出先升后降的趨勢，清蛋白含量變化與種子內蛋白質合成相關酶活力有關[22]；環境對芝麻種子中清蛋白組分含量影響不大，這與張學林等[23]研究結果不同，這可能是由于本研究試驗點設置緯度差異較小。清蛋白和球蛋白是芝麻蛋白重要組分，成熟種子中占粗蛋白總量的 13.75%和 70.94%，對芝麻清蛋白和球蛋白進行分離純化，并對其性質進行研究對芝麻蛋白質加工利用具有重要作用。醇溶蛋白中含有賴氨酸，精氨酸和組氨酸等必需氨基酸[24]，在芝麻種子的整個生長發育過程醇溶蛋白含量較低且變化不顯著，這與芝麻種子蛋白質中賴氨酸含量較低有一定關系；醇溶蛋白和谷蛋白含量較低，芝麻蛋白質的性質與小麥和玉米的蛋白質有較大區別。

豫芝11號種子發育過程中蛋白質主要集中在20 kD和31 kD處，在授粉后10 d出現模糊條帶后條帶逐漸加深至種子成熟，授粉后15 d，在37 kD和50 kD處出現條帶，且隨著種子發育時間的延長，37 kD處條帶逐漸消失而50 kD處條帶數增加，表明不同蛋白質在種子中合成時期不同，隨著種子發育時間的延長，小分子蛋白質逐漸轉化為大分子。芝麻蛋白質相對分子質量主要集中在 20—30 kD，此類蛋白質廣泛存在于豆類植物中，對種子儲藏蛋白形成具有重要意義[25]。

芝麻種子中含有17種氨基酸，其中谷氨酸和精氨酸含量最高。谷氨酸能與氯化鈉反應產生鮮味[26]，精氨酸對芝麻油風味的形成具有重要作用[27-29]。隨著種子發育時間的延長，必需氨基酸占總氨基酸含量逐漸下降，周口試驗點必需氨基酸占總氨基酸比例顯著高于南陽和駐馬店試驗點，這與常旭虹等[30]研究小麥種子中必需氨基酸占總氨基酸比例隨緯度升高而增大的結果一致；通過芝麻氨基酸評分和比值系數分的比較發現，芝麻種子發育過程中限制性氨基酸依次為蛋氨酸，蘇氨酸和賴氨酸；一方面，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸比值系數大于 1，芝麻蛋白能夠很好的補充纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸；另一方面，在芝麻授粉后25 d，氨基酸比值系數分達到最大，周口試驗點評分顯著低于南陽和駐馬店試驗點，表明生長環境對必需氨基酸的合成有一定影響，這與SHEWRY等[31]研究結果一致。賴氨酸含量呈現先增后減的趨勢，其變化規律與清蛋白含量具有一致性，但其聯系未探明。

4 結論

生長環境對芝麻蛋白質含量影響顯著，通過改變芝麻生長環境可顯著提高芝麻籽粒中蛋白質含量。球蛋白含量變化趨勢與粗蛋白含量具有一致性，清蛋白在生長過程中受環境影響顯著，其變化趨勢與籽粒中賴氨酸含量具有一致性；芝麻蛋白質分子相對分子質量主要集中在20—30 kD，此類蛋白質對種子儲藏蛋白具有重要意義，研究此類蛋白質性質，對芝麻蛋白加工利用具有重要意義；隨著生育期的延長，芝麻種子中必需氨基酸占總氨基酸含量逐漸降低，第一限制性氨基酸隨生長發育期的延長而變化，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸＋酪氨酸在氨基酸評分過程中比值系數始終大于1。

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