基于SNP芯片揭示中國玉米育種種質的遺傳多樣性與群體遺傳結構

趙久然，李春輝，宋偉，王元東，張如養，王繼東，王鳳格，田紅麗，王蕊

（北京市農林科學院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京100097）

0 引言

【研究意義】玉米在長期的馴化過程中，表型和基因型水平上都形成了極為豐富的遺傳多樣性。這些多樣性的種質資源中，很多已經被廣泛應用到玉米育種實踐，對中國玉米育種發展起到了重要的作用。種質資源的遺傳多樣性與群體結構分析，可以揭示資源的遺傳特性，為育種家選材提供信息，并為后續的種質改良與品種選育提供參考。【前人研究進展】中國玉米自交系主要來源于國內地方種和外來種質[1]。在中國玉米品種改良過程中，發掘和利用地方種質是解決品種適應性問題的重要途徑[2]，其中貢獻最大的是以丹340為代表的旅大紅骨種質和以黃早四為代表的黃改群（塘四平頭）種質，這兩個本地化雜種優勢類群經過多年的改良和利用，形成了很多在育種實踐中廣泛應用的骨干自交系。20世紀50年代后期，美國單交種開始出現并被大面積應用，形成了 SS群體、NSS群體和Iodent群體3個主要的雜種優勢類群，并且從20世紀70—80年代開始引入中國，先后引入少數優良自交系，如Oh43、C103、B73、Mo17等代表系，這些自交系經遺傳改良形成了中國雜種優勢類群中的蘭卡斯特種質和瑞德種質[3]。隨著國外商業化雜交種被大量研制，很多國外優秀雜交種的二環系選系逐漸成為新自交系的主要來源，20世紀70年代末，從引進的國外商業化雜交種中選育出了掖 8112、鐵7922、沈5003、掖478、鄭58等優良自交系，形成了中國的改良瑞德類群[4]。20世紀70—80年代，以先鋒雜交種P78599選系為代表，選育出齊319、X178等材料，形成了 P群種質[5]。近年來，北京市農林科學院玉米研究中心利用外來新種質X1132X作為基礎材料，通過在高密度、大群體、變換地、強脅迫等條件下進行嚴格選擇，選育出京724、京725、京464、京MC01等一批優良骨干自交系[6]。在此基礎上，以自交系京92和京2416等黃改系作為父本，探索創新了雜種優勢模式，組配出京科968（京724×京92）、京科 665（京 725×京 92）、NK718（京 464×京 2416）和京農科728（京MC01×京2416）等系列玉米新品種[7]。由于玉米育種實踐的不斷推進、研究材料的差異、分子標記類型和數量的差異等因素的存在，研究者對中國玉米種質的遺傳評價從未停止過。比較前人的研究結果發現，由于研究者利用 RAPD、RFLP、AFLP、SSR和SNP等不同的分子標記，對不同玉米種質進行遺傳評價和聚類分析[7-13]，因此得出的結論稍有差異，但一般都會有黃改群、旅大紅骨群、瑞德群、蘭卡斯特群等幾個種質群，有一些研究中劃分出了P群、改良瑞德等類群。【本研究切入點】隨著玉米育種實踐的不斷推進，大量優異玉米種質被不斷培育和釋放。由于新種質不斷被應用，有必要更全面地收集目前品種選育中應用的種質，對已有雜優模式和創新雜優模式的各類群玉米自交系做更系統的分析。【擬解決的關鍵問題】本研究344份玉米自交系包含了當前或歷史上玉米育種中應用的重要種質資源，并收納了美國三大主要雜種優勢群的代表系，具有廣泛的代表性。利用覆蓋全基因組的SNP位點，揭示上述重要玉米育種種質的群體結構和遺傳多樣性，并探討玉米種質在改良過程中基因多樣性的變化趨勢，全面闡述中國玉米種質的遺傳特征，為玉米育種實踐提供指導和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料由344份玉米自交系組成（電子附表1），包括（1）美國主要雜種優勢群瑞德群、蘭卡斯特群、Iodent群；（2）由國內地方種質發展出的黃改群和旅大紅骨群；（3）從美國商業化雜交種選系發展出的改良瑞德群和 P群；（4）近年來，在中國玉米育種中應用的新種質。供試自交系能夠反映目前中國玉米生產中應用的種質資源的遺傳多樣性，具有較為廣泛的代表性和時效性。

1.2 基因型鑒定

利用北京市農林科學院玉米研究中心研發的包含3 072個SNP位點的MaizeSNP3072芯片對供試自交系進行基因型分析。每個樣品取50—60單株葉片形成一個混池，按照改進的CTAB法提取基因組DNA[14]。利用 iScan芯片掃描儀獲取高分辨率的圖片，所得數據直接導入GenomeStudio software v2011.1（Illumina and GoldenGate data）軟件，利用北京市農林科學院玉米研究中心確定的基因分型文件自動分析，獲得每個樣本的基因型數據。從基因型數據中過濾掉分型較差的SNP位點和缺失率大于50%的位點，從而得到了2 869個高質量的SNP位點，這些位點的基因型數據將用來進一步分析。

1.3 數據分析

利用PowerMarker V3.25軟件[15]計算多態信息含量（PIC）、平均等位變異和基因多樣性等。利用PowerMarker 結合 MEGA 4.0[16]計算 Nei’s 遺傳距離[17]。基于2 869個均勻分布的高質量SNP標記，利用Structure V2.3.3[18-19]判斷所有自交系的群體結構。設置burn-in步長為10 000，MCMC迭代次數為100 000，對于每一個K值，分別進行16次獨立的重復，研究材料的類群個數通過 ΔK確定[20]，多次運行結果用CLUMPP軟件[21]整合。利用 Arlequin V3.11[22]計算AMOVA[23]和類群之間的遺傳分化系數（Fst）。基于各類群自交系的Rogers（1972）遺傳距離，利用NTSYS pc V2.10y軟件中的Dcenter與Eigen模塊對這些類群進行主成分分析，明確各類群自交系的分群特征。

2 結果

基于2 869個SNP位點分析的344份玉米種質的基因多樣性為0.028—0.646，平均為0.442；PIC值為0.028—0.570，平均為 0.344（表 1）。2 869個 SNP標記中，有59.3%（1 702個）的SNP標記基因多樣性處于0.45—0.50，具有較高的多態性水平。

2.1 群體結構

利用Structure軟件對這些自交系的群體結構進行系統解析。當類群數（K值）在1—10變化時，對于每個指定的K值，LnP(D)值隨著K值的增加持續上升，未出現明顯的拐點（圖1-a）；ΔK值在K=8時達到最大值（圖1-b），表明344份自交系可以劃分為8個類群。基于2 869個SNP標記分析研究材料的遺傳組分在各個類群中的百分比，當以50%類群屬性比率作為劃分依據時，344份自交系中有235份（68.3%）被劃分到8個類群中，而其余的109份（31.7%）則沒有明確的類群歸屬特性（電子附表 1）。根據各類群所包含材料的系譜等信息，這8個類群依次確定為旅大紅骨群（Lüda red cob，LRC）、黃改群（Huangzaosi improved lines，HIL）、Iodent群（Iodent，IDT）、蘭卡斯特群（Lancaster，LAN）、X群（X group，X）、改良瑞德群（Improved Reid，IR）、瑞德群（Reid）和P群（P group，P）（圖1-c、表1）。

在8個類群中，旅大紅骨群、黃改群、Iodent群、蘭卡斯特群、X群、改良瑞德群、瑞德群、P群各自包含21、37、17、23、24、35、39和39份材料，分別占總材料數的6.1%、10.6%、4.9%、6.7%、7.0%、10.2%、11.3%和11.3%。其中旅大紅骨群、黃改群、蘭卡斯特群、改良瑞德群、瑞德群、P群在前人研究中都有報道[8-13]，均為玉米育種中常用的雜種優勢群；美國三大雜種優勢群之一 Iodent種質在國內應用較少，近年有上升的趨勢；X群是指利用外來新種質X1132X等作為基礎材料選育而成的自交系群體。

2.2 群體分化及主成分分析

AMOVA結果表明類群間存在顯著的遺傳變異，占總遺傳變異的38.6%，類群內的遺傳變異為58.1%，自交系內的為3.3%。比較8個類群，遺傳距離為0.229—0.514，Fst為0.319—0.512（表1）。各類群與X群比較，X群與蘭卡斯特群、黃改群兩者的遺傳距離較大，與瑞德群、Iodent群之間的遺傳距離較小。各類群與黃改群比較，黃改群與X群、蘭卡斯特群、P群的遺傳距離較大，與旅大紅骨群之間的遺傳距離較小。從遺傳分化上來看，類群之間的關系也存在同樣的趨勢。

圖1 344份自交系的群體結構分析Fig. 1 Clustering analysis of 344 inbred lines via the model-based method

表1 類群間遺傳距離及遺傳分化系數（Fst）Table 1 Genetic distances as measured by Nei’s distance (top diagonal) and pairwise Fst comparisons (bottom diagonal) between maize inbred groups

主成分分析結果顯示，比例最高的3個主成分分別占總遺傳組成的16.88%、15.13%和9.85%，取前3個主成分利用三維主成分圖解釋類群之間的遺傳關系。從不同角度觀察三維主成分圖（圖 2），瑞德群與蘭卡斯特群處于三維圖的兩端，在種質資源實際的育種應用中，2個群之間可以形成強雜種優勢；黃改群與旅大紅骨群關系較近，二者均為中國地方種質選系、經過后續育種改良形成的群體，因此關系較近與實際情況相符；黃改群與X群、改良瑞德和蘭卡斯特群關系較遠，黃改群與以上3個類群均有很強的雜種優勢，并在中國形成了很多大面積推廣的品種，如京科968、鄭單958等；X群與Iodent群關系最近，與黃改群、蘭卡斯特群等遺傳關系最遠。以上結果和群間遺傳距離有很高的一致性。

圖2 根據遺傳相似矩陣對344份玉米自交系進行主成分分析Fig. 2 Genetic relationship among 344 maize inbred lines revealed by principal coordinate analysis

2.3 群體遺傳多樣性

基于2 869個SNP位點分析的344份玉米種質的基因多樣性為 0.028—0.646，平均為 0.442；PIC值為0.028—0.570，平均為0.344（表2）。不同類群的遺傳多樣性也存在一定差異，其中旅大紅骨群、改良瑞德群、X群和黃改群具有較高的基因多樣性（0.300、0.297、0.284和 0.274）和多態信息含量（0.243、0.241、0.228和0.226）；而 Iodent、蘭卡斯特和瑞德等國外自交系的基因多樣性（0.233、0.250和 0.247）和多態信息含量（0.193、0.209和0.202）則較低。

表2 類群的基因多樣性和多態信息含量Table 2 Summary statistic of genetic diversity for model-based groups

2.4 位點多樣性反應育種潛力和改良進程

品種產量水平提升的速度和潛力很大程度上取決于擁有種質資源的多樣性程度。植物育種要求種質要有豐富的遺傳變異[24]，但育種過程通常又會減少遺傳多樣性，隨著商業育種的進行，自交系遺傳基礎狹窄的問題越來越突出，這使得在中國廣泛種植的雜交種遺傳脆弱性增加，大大增加對病蟲害的發病風險，使農業生產面對越來越大的經濟風險。由于群體大小和種質改良年代的限制，所有位點并不能全部表現出多態性，選取各類群的多態性位點，其遺傳多樣性水平一定程度上反映了種質育種潛力。隨著種質改良的進行，群體遺傳多樣性將會有一定程度的衰減。本研究的結果也證明了這一點，對各類群的位點遺傳變異程度進行比較分析發現（圖3），改良歷史較長的美國種質類群（蘭卡斯特群、瑞德群、Iodent群）位點平均多態性水平最低；改良歷史次之的國內地方種質旅大紅骨群和黃改群位點平均多態性水平有一定程度的升高；20世紀70—80年代引入的美國商業化雜交種選系改良瑞德和 P群，位點平均遺傳多態性進一步升高；近年選育的X群種質多態性最高。以上結果說明平均位點多態性和改良年代有很大關系，改良年代越長，類群遺傳基礎越狹窄，平均位點多態性越低。

種質改良會引入其他血緣材料，在供試自交系中，有很大比例的材料（31.7%）沒有明確的類群歸屬特性，這些材料大多為育種改良過程中產生的中間材料，血緣成分比較復雜。以占比最高的遺傳組分確定自交系的類群歸屬，當分別以20%、35%、50%和65%的遺傳組分作為類群屬性比率的閾值時，各類群材料趨向于保留最具代表性的種質，隨著類群屬性比率閾值的升高，位點基因多樣性有著不同程度的降低（圖4），其中美國種質類群（蘭卡斯特群、瑞德群和Iodent群）和國內地方種質改良系（旅大紅骨群和黃改群）代表性的材料多樣性下降幅度較大，美國商業化雜交種選系P群和改良瑞德群下降幅度較小，而X群代表性的種質則沒有下降趨勢（圖 4）。這種趨勢也和育種改良年代相吻合，育種改良年代越久，群內代表性的種質多樣性下降程度越明顯，X群由于是近年來選育出來的優新種質，依然保留了很高的遺傳多樣性，未來還有很高的育種潛力可挖掘。

圖3 8個類群的多態性位點基因多樣性Fig. 3 Genetic diversity of polymorphism sites for 8 model-based groups

3 討論

本研究所分析的344份玉米自交系，包含中國當前或歷史上玉米生產中應用的重要種質資源，因為X群是美國雜交種選系，所以收納了美國三大主要雜種優勢群的代表系。從前人對中國玉米自交系的類群劃分來看，不同研究在類群個數和類群之間的關系上存在一定的差異[7-12]。由于加入了近年來應用到育種中的新種質（X群種質等），類群個數和類群之間的關系和以前的研究有所不同，本研究群體結構分析將X群種質獨立成群，并進一步對這一新的種質類群進行了系統的遺傳分析。本研究引入的X群種質，近年在生產實踐中獲得很大成功，特別是北京農林科學院玉米研究中心堅持利用“高大嚴”選系技術選育出的京724、京725、京464、京MC01、D9H等一系列X群自交系，與黃改群種質京92和京2416組配雜交種，已經通過審定并在生產中大面積推廣。X群具有良好的豐產性和抗逆性，同時也具有熟期合適、子粒脫水速度快等適宜機械化收獲的優良性狀[6]。

縱觀中國玉米品種改良進程，品種水平的每一次大幅提高都與關鍵種質的發掘或引進密切相關。其中，從國外引入的自交系和國外商業雜交種選系起到了重要的作用，例如瑞德種質、蘭卡斯特種質、改良瑞德種質、P群種質和X群種質等。把外來種質導入國內種質能有效增加遺傳變異性，并產生更強的雜種優勢[25]。中國玉米單交種最主要的雜優模式均屬于國內種質×國外種質[26-27]。綜合類群間遺傳距離、Fst和PCA的分析結果，黃改群與X群、改良瑞德群和蘭卡斯特群遺傳關系最遠，這三種雜優模式全部為國內種質×國外種質。經生產實踐證明，黃改群可以與X群、改良瑞德群和蘭卡斯特群形成強雜種優勢，并已經培育出大面積推廣的品種，其中利用X群×黃改群雜優模式，育成了京科968、京科665、NK718和京農科728等雜交種，此模式與鄭單958、先玉335等中國已有推廣品種的雜優模式均不同，是一種新型雜優模式。“X群×黃改群”雜優模式聚合了X種質的高配合力和黃改種質的強適應性，通過近年來育種實踐和大面積生產證明，已成為中國玉米生產上快速上升的主要雜優模式。

國外種質資源可與本地資源形成優勢互補，對中國玉米新品種選育作用巨大，但國內育種實踐中應用的國外種質依然有限，仍有很多玉米種質需要育種家去挖掘，以形成更強的雜種優勢，提高玉米產量，滿足世界人口不斷增長對糧食的需求。黎裕等[28]研究表明，到20世紀末，在45類美國基礎種質類型中，有23類種質從未應用于中國玉米育種，同時還發現，與美國近代雜交種相比，中國品種含有較低比例的Iodent、Reid黃馬牙等遺傳組分。總體上中國玉米育種利用的基礎種質類型仍然偏少，建議引入更多類型的種質材料，在中國玉米雜種優勢利用模式下，進行育種價值的評估，以應用于中國玉米品種改良。主成分分析結果顯示，X群種質與Iodent種質遺傳距離相對較近，Iodent種質并未得到大規模的引進和利用，因此X群的成功引入和應用，拓寬了中國玉米育種實踐對國外種質的利用。

圖4 8個類群的位點平均基因多樣性和類群屬性比率閾值的關系Fig. 4 The relationship between genetic diversity of polymorphism sites and group attribute ratios for 8 model-based groups

4 結論

利用覆蓋玉米全基因組的MaizeSNP3072芯片，對344份代表中國玉米育種種質資源基礎的自交系進行全基因組掃描。群體結構分析將344份自交系劃分為8個類群，分別為黃改群、瑞德群、蘭卡斯特群、旅大紅骨群、P群、改良瑞德群、Iodent群和X群，其中 X群與黃改群、蘭卡斯特群遺傳關系較遠，與Iodent群遺傳關系較近。類群的平均位點遺傳多樣性與改良年代關系較大，X群為近年來創新種質，位點平均多樣性最高，可選擇利用潛力大。X群和黃改群形成的京科968系列品種的雜優模式“X群×黃改群”為一種新的雜優模式，并正在成為中國玉米生產中的主要雜優模式。

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