水稻早衰突變體es5的鑒定及其突變基因的精細定位

王備芳，陳玉宇，張迎信，劉群恩，孫濱，向小嬌，曹永潤,2，程式華，曹立勇

（1中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室/浙江省超級稻研究重點實驗室，浙江富陽311401；2河南農業大學農學院，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】衰老是植物自發啟動的一個細胞程序性死亡過程，受遺傳和外界因子（高溫、干旱、病蟲害、激素和光照等）的共同調控[1]。葉片是植物發育過程中重要源器官，是植物光合作用的重要場所，為植物提供大部分能量和有機物質。水稻生物產量和經濟產量的形成主要依賴于光合作用，而水稻早衰一般首先發生在葉片上，水稻葉片早衰一般涉及葉綠體發育、葉綠素降解、激素和自由基代謝等過程[2-3]。葉片早衰導致植物光合能力降低，引起作物籽粒灌漿不足、結實率下降、千粒重減小等，嚴重影響水稻的產量和質量[4]。因此，克隆水稻早衰相關基因對探索植物早衰機制、進行水稻遺傳改良具有重要的意義。【前人研究進展】研究人員一般將衰老基因分為兩類：一類是衰老下調基因，這類基因隨著葉片的衰老表達受到抑制[5]；第二類基因為衰老上調基因，這類基因有的在衰老期間被激活，有的在植株發育早期表達水平低，但衰老過程中基因表達量升高[6-7]。在水稻中已經定位和克隆了大量的衰老相關基因，根據這些基因參與的代謝途徑與信號通路劃分，大致可以分為葉綠體發育和降解的相關基因NYC1[8]、RLS1[9]、OSPAO[10]、NYC4[11]、NYC3[12]、Osh69[13]、SGR[14]、Sgr[15]和OSRCCR1[10]、蛋白質合成和降解相關基因ospse1[16]、OsSWEET5[17]和PSL2[18]、激素途徑相關基因OsDos[19]和 OsSAMS1[20]、細胞程序性死亡相關基因 SPL28[21]和 SPL33[22]及早衰和其他途徑相關基因 lms[23]、psd128[24]、RLS3[25]、Osl2[26]、YGL1[2]、Es7(lmes1)[27]、spl32[28]和SPL29[29]等基因。研究報道已經定位的水稻衰老相關基因有 Psl1[30]、D343[31]、lst[32]、esl5[33]、esl2[34]、D101[31]、yld1[35]、Psl3[36]、Pse(t)[37]、Sms1[38]、esl6[39]、pgl3-t[40]、ES10[41]和 Lad[42]等。目前，已經定位和克隆的位于第 5染色體的基因有 OsSAMS1[20]、OsTZF1[43]、OsRab7B3[44]、OsSWEET5[17]、esl3[45]和es-t[46]。葉片衰老是一個復雜的生物學過程：不僅涉及多類基因、多種細胞代謝途徑，而且其過程極易受內外環境影響，遺傳機制極其復雜。研究者們通過基因克隆和全基因組分析等技術，已構建了植物衰老的部分分子調控網絡結構，但其機理仍然不夠清晰。【本研究切入點】ES5的表型與目前已克隆的其他早衰基因表型明顯不同，且目標區間內未有早衰相關基因報道，因此，推測 ES5是一個新的早衰調控基因，克隆該基因并對其功能進行研究有利于進一步揭示水稻葉片早衰機制。【擬解決的關鍵問題】es5是在以嘉禾 212為背景的突變體庫中篩選到的一份葉片早衰突變體材料，本研究對該突變體進行形態分析、遺傳分析以及基因精細定位，為該基因克隆和功能分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用EMS誘變粳稻嘉禾212，從其后代中鑒定出一個葉片早衰突變體，經多代自交后形成突變表型穩定的突變體，命名為 es5。以 es5為母本，秈稻中恢8015為父本，配制雜交組合得到 F1，F1自交獲得 F2分離群體，利用 F1和 F2群體進行遺傳分析和基因定位。所有材料2015年至2017年種植于中國水稻研究所杭州實驗基地和海南陵水基地，單株種植，每行 8株，株行距16.5 cm×26.5 cm，管理同大田生產。全生育期觀測es5與嘉禾212的表型差異。隨機選取生長一致的突變體與野生型植株各 10株對株高、千粒重、結實率等農藝性狀進行考察，取平均值進行數據分析。

1.2 細胞組織化學染色

1.2.1 二氨基聯苯胺（DAB）染色 利用二氨基聯苯胺（diamino benzidine，DAB）染色可以直接觀察植物組織中 H2O2的積累。DAB染色參考 THORDALCHRISTANSEN等[47]的方法。始穗當天取es5和嘉禾212倒二葉葉片浸于1 mg·mL-1的DAB染液中，抽真空室溫浸泡10 h后用清水沖洗干凈，然后放入95%乙醇中加熱煮沸50 min脫色至葉片接近白色。脫色后葉片放入95%乙醇繼續浸泡5 h后拍照。

1.2.2 伊文思藍染色 伊文思藍染色可以直接觀察植物組織中的死細胞情況。伊文思藍染色參考KONG等[48]和 LI等[49]的方法，始穗當天取 es5和嘉禾 212倒二葉葉片浸于0.25%染液中抽真空后浸泡10 h，清水沖洗干凈后放入95%乙醇中加熱煮沸50 min脫色至葉片接近白色。脫色后葉片放入95%乙醇浸泡5 h后拍照。

1.3 凈光合速率和光合色素含量測定

選擇晴天上午 9：30—11：00，在大田隨機選取具有代表性的es5和嘉禾212各3株，利用LI-6400XT便攜式光合測定儀分別對其劍葉、倒二葉、倒三葉進行測定[50]。光合測定儀使用紅藍光源，開放氣路。參數設置：光量子密度 1 200 μmol·m-2·s-1，流速 500 μmol·s-1。每株每葉重復3次算平均值作為一次重復，重復3次取平均值進行統計計算。

葉綠素含量測定，參照ARNON[51]和PORRA等[52]的方法。分別取生長于大田條件下的 es5和嘉禾 212抽穗期劍葉、倒二葉和倒三葉葉片。去除葉片主葉脈后將其剪成0.5 cm左右的小段，分別稱重0.1 g左右，放入10.0 mL 80%丙酮中，黑暗條件下浸泡24 h，每隔8 h到10 h震蕩混勻一次以便光合色素充分溶解。每組3次生物學重復。將提取液在DU800可見-紫外分光光度計中進行測定，以80%丙酮為空白對照調零，分別在470、645和663 nm波長下測定光吸收值并根據已有公式計算光合色素含量。葉綠素a（Chl a）、葉綠素 b（Chl b）計算公式：Chl a＝(12.7OD663-2.69OD645)×V/W；Chl b＝(22.9OD645-4.68OD663)×V/W；Car＝(1000 OD470×V/W-3.27chl a-104chl b)/198。V表示提取液的體積（10-3L），W表示葉片的重量（g）。

1.4 酶活性和衰老相關生理生化指標的測定

取es5和嘉禾212抽穗7 d后和21 d后新鮮劍葉，每份稱取0.2 g，放入預冷的研缽中，加入0.1 mmol·L-1的磷酸緩沖液8 mL和少量的石英砂，進行冰浴研磨。在4℃ 3 500 r/min離心15 min，取上清液用于超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase）、可溶性蛋白含量 SP（soluble protein）、丙二醛 MDA（malonaldehyde，MDA）含量測定。SOD活性、SP含量、MDA含量測定參照李合生[53]的方法測定。每個樣品3個重復。取平均值進行統計計算。

1.5 透射電鏡觀察

選取大田正常生長的es5和嘉禾212植株，始穗當天取es5和嘉禾212倒二葉，去除主脈，剪成約0.5 cm的小段立即置于裝有2.5%戊二醛固定液的50 mL離心管中，抽真空約2 h，使葉片完全沉于管底。4℃固定1 d。脫水、滲透包埋、切塊、染色及電鏡觀察等步驟委托浙江大學電鏡中心完成。

1.6 遺傳分析

利用 es5與秈稻材料中恢 8015雜交獲得 F1，F1自交獲得分離群體F2。觀察F1和F2的表型，并統計F2群體中早衰植株與正常植株的分離情況，用SAS軟件進行卡方適合性檢驗。

1.7 基因定位

以es5與秈稻材料中恢8015為親本雜交獲得F1，F1自交得到F2定位群體，取1 280株隱性單株葉片用 CTAB[54]法提取 DNA。隨機混合 8個隱性單株DNA構建突變體基因混池，利用均勻分布于12條染色體上且在雙親間呈多態性的 154對引物分別對該混池以及雙親進行基因型分析篩選連鎖標記，隨后用獲得的連鎖標記繼續分析 152個隱性單株基因型，對目的基因進行初步定位。根據初定位區間，從Gramene（http:// ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html）上下載該區間秈稻 93-11和粳稻日本晴的基因組序列，比對序列尋找插入/缺失（InDel）位點，用 Primer Premiers 5.0軟件開發InDel分子標記（表1），用新開發的有多態標記分析全部1 280個隱性單株基因型對目的基因進行精細定位（引物由杭州擎科生物技術有限公司合成）。PCR擴增采用杭州擎科生物技術有限公司的 2×Taq PCR Mix，PCR反應體系為DNA模板2 μL、2×Taq PCR Mix 5 μL、正向引物 1 μL、反向引物 1 μL 和 ddH2O 3 μL。反應程序為 95℃ 4 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環；72℃ 8 min。PCR擴增產物經8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后觀察。候選基因分析參照水稻基因組注釋信息數據庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/）。

1.8 水稻衰老相關基因表達量分析

取抽穗期 es5和嘉禾 212的劍葉采用 QIAGEN RNeasy PlantMini試劑盒提取總RNA，提取方法參照說明書。反轉錄使用qPCR RT Master Mix試劑盒，反應體系及反應條件參照說明書。內參基因為 Actin（GenBank登錄號為 NM_001058705），利用實時熒光定量 PCR分析各基因在野生型嘉禾 212及突變體es5中的表達量，熒光定量PCR反應體系為cDNA模板 2 μL、2×SYBR qPCR mix 10 μL、正向引物 0.5 μL、反向引物0.5 μL和ddH2O 7 μL。反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，40 個循環。每個樣品3個重復。以2-△△CT計算各基因的相對表達量。熒光定量PCR所用引物見表1。

表1 基因定位及qRT-PCR所用的引物序列Table 1 Primers used for mapping and qRT-PCR

2 結果

2.1 es5表型分析

es5是嘉禾212經EMS誘變篩選獲得，四葉期前es5表型與嘉禾 212相比無明顯差異，四葉期時 es5下部葉片葉尖開始黃化衰老。同時，隨著植株的生長發育，葉片的衰老面積逐漸增大，至拔節期中下部葉片衰老黃化（圖1）。對es5與嘉禾212的農藝性狀考察發現，由于突變體的過早衰老，其光合能力降低從而影響到整個植株的生長發育。es5的株高、有效穗數、每穗總粒數、千粒重、結實率等農藝性狀都極顯著下降，分別為嘉禾 212的 62.01%、30.91%、36.01%、90.59%和70.67%（表2）。由此可見葉片早衰嚴重影響株高、有效穗數、每穗總粒數、千粒重、結實率等重要的產量性狀。

2.2 組織化學分析

葉片衰老伴隨著細胞死亡，從而導致細胞中大量H2O2等活性氧的積累。伊文斯藍溶液可以進入細胞膜損傷或者死亡細胞內并呈現出藍色。因此，伊文思藍染色是檢測膜損傷或細胞死亡的組織化學指標。伊文思藍染色后，可觀察到es5葉片表現出深藍色斑點，但嘉禾212葉片染色不明顯（圖2-A），說明es5葉片中有更多的壞死細胞。植物體內的H2O2在經過氧化物酶催化釋放出的氧可以與 DAB反應呈現紅褐色。DAB染色結果顯示，es5葉片有大面積的紅褐色沉淀，而嘉禾212幾乎無褐色沉淀，表明es5葉片中有大量H2O2積累（圖2-B）。

表2 野生型嘉禾212和突變體es5的主要農藝性狀比較（均值±標準差，樣本數=10）Table 2 Comparison of agronomic traits between wild type Jiahe212and mutant es5 (mean ±SD, n=10)

圖1 野生型嘉禾212和突變體es5的表型特征Fig. 1 Phenotypes of wild type Jiahe212 and mutant es5

圖2 野生型嘉禾212和突變體es5葉片的組織化學染色Fig. 2 Histochemistry staining of leaves of wild type Jiahe212 and mutant es5

2.3 光合色素含量和光合指標測定

通過對es5和嘉禾212抽穗期劍葉、倒二葉、倒三葉的葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量和凈光合速率進行測定。結果顯示，相較于嘉禾212，es5劍葉、倒二葉及倒三葉的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和凈光合速率均有所下降，部分指標差異極顯著（圖 3）。表明es5葉片的提前衰老導致葉片中光合色素含量下降，光合速率極顯著降低，嚴重影響了水稻植株的光合能力。

2.4 酶活性和衰老相關參數的測量

超氧化物歧化酶（SOD）是一種活性氧清除劑，當細胞內的 SOD活性降低時，細胞內的活性氧不能得到及時清除，導致活性氧在細胞內大量積累，最終引起細胞膜脂過氧化。丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化的產物之一，丙二醛含量越高代表細胞膜脂的過氧化程度越高，是衰老的重要指標。植物葉片衰老還引起蛋白含量的降低，蛋白質被分解成多肽和氨基酸進而被轉運到植物幼嫩組織中。取抽穗前期（7 d）和抽穗后期（21 d）es5和嘉禾212劍葉測定SOD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量。發現從抽穗前期（7 d）到抽穗后期（21 d），es5葉片中的SOD活性均顯著高于嘉禾212中SOD活性（圖4-A）；MDA含量在抽穗前期差異不顯著，在抽穗后期es5中MDA含量顯著高于嘉禾212中MDA含量（圖4-B）；抽穗前期和抽穗后期es5葉片中可溶性蛋白含量均極顯著低于嘉禾212中可溶性蛋白含量。綜上所述，es5衰老速度高于嘉禾212（圖4-C）。

2.5 es5葉綠體降解加速

圖3 野生型嘉禾212和突變體es5抽穗期劍葉（F），倒二葉（S），倒三葉（T）葉片的凈光合速率和光合色素含量（均值±標準差，樣本數=3）Fig. 3 Net photosynthetic rate and photosynthetic pigments content of the wild type Jiahe212 and mutant es5 in the flag leaf(F), the second upper leaf (S) and the third upper leaf (T) at heading stage (means ± SD, n=3)

圖4 抽穗期野生型嘉禾212和突變體es5的生理學特征Fig. 4 Physiological characters of wild type Jiahe212 and mutant es5 at heading stage

表3 es5的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of es5

利用透射電鏡觀察es5和嘉禾212植株葉綠體超微結構，取抽穗當天es5和嘉禾212倒二葉進行透射電鏡觀察。結果顯示，嘉禾212葉綠體呈紡錘狀，葉綠體內類囊體排列整齊，片層結構清晰，基粒堆疊致密。而es5衰老部位葉肉細胞則發生了顯著的變化，整個細胞死亡特征明顯，其細胞質溶解，葉綠體結構異常，葉綠體膜溶解，基粒模糊，基質片層疏松，類囊體發育異常，淀粉顆粒增多（圖 5）。說明es5衰老部位葉肉細胞葉綠體已經發生降解，不能正常進行光合作用。

2.6 es5遺傳分析

將es5和秈稻中恢8015雜交，F1植株葉片為正常表型。F2群體中出現性狀分離。在隨機挑選的 250棵F2單株中，68株表現早衰表型，182株表現正常。經卡方（χ2）測驗，符合 3∶1 的分離比 χ2=0.65＜χ20.05= 3.84（表3）。表明es5早衰性狀由一對核隱性基因控制。

圖5 野生型嘉禾212和突變體es5葉片的透射電鏡觀察Fig. 5 Transmission electron microscopy (TEM) analysis of chloroplast in wild type Jiahe212 and mutant es5

2.7 目的基因定位

通過es5和秈稻中恢8015衍生出的F2群體來用于es5的初定位，選用均勻分布在12條染色體上且在嘉禾212和中恢8015間呈多態的154對SSR和InDel標記，分析突變體混池基因型，結果表明，位于第 5染色體長臂的標記RM6841和RM5907與早衰表型連鎖。從Gramene下載更多的SSR標記，通過分析152株隱性植株的基因型，將es5初步定位在RM3486和RM3664兩對標記之間（圖6-A）。為精細定位ES5，在RM3486和RM3664之間，新開發2對多態性好的InDel引物（表 1），運用新標記和已有 SSR標記進一步分析1 280個隱性單株基因型，通過連鎖分析，將目的基因定位于標記4BF-10和RM3664之間的52.7 kb物理區間內（圖6-B）。參考水稻基因組注釋計劃數據庫（http://rapdb.dna.affrc.go.jp），該區間內共包含8個候選基因。對候選基因的確定還有待進一步的序列分析。

2.8 衰老相關基因的表達量分析

在植物衰老過程中，植物體內與衰老相關的基因會被誘導表達。利用qRT-PCR分析抽穗期es5和嘉禾212中衰老基因的表達量。Osh36[55]編碼一個氨基酸轉移酶與自然葉片衰老有關；Osh69[13]和OsI85[55]分別編碼種子休眠蛋白和異檸檬酸裂解酶，是水稻葉片衰老的標志基因；SGR[14]和RCCR1[10]分別編碼葉綠體轉運肽蛋白和紅色葉綠素代謝產物還原酶與葉綠體降解相關。qRT-PCR分析結果顯示，es5中衰老相關基因Osh36、Osh69、OsI85和RCCR1極顯著上調（圖7），2個衰老的標志基因Osh69和OsI85表達量分別上調12.7和36.6倍。同時葉綠素降解相關基因SGR也顯著上調（圖7）。

圖6 es5的精細定位Fig. 6 Fine mapping of es5

圖7 衰老及光合作用相關基因表達量分析Fig. 7 qRT-PCR analysis of senescence and photosynthesis associated genes

3 討論

目前，在水稻中已經鑒定出 150多個葉色以及衰老相關基因，但被克隆的僅有50多個。已被定位的早衰相關基因在除第1、第8和第12染色體外的其他9條染色體上均有分布，其中在第5染色體上主要有ES-T和esl3（表4）。根據定位結果顯示，es5與目前報道的衰老基因均不等位，為一個新的早衰基因。

本研究中的es5四葉期下部葉片就開始黃化，抽穗期倒二葉、倒三葉衰老現象嚴重，倒四葉片死亡。其表型與已報道的早衰突變體psl1、psl2、psl3、pse(t)、esl2、es-t、esl3和lad均有明顯的差別。psl1形態特點是自苗期葉片就開始變黃衰老，葉片全展后葉尖就開始枯萎；psl2在播種后6—8周出現早衰表型，抽穗時衰老最明顯，大部分葉片黃化死亡；psl3是從第 5葉葉尖開始黃化衰老，6葉期后黃化面積逐漸增大并向葉片中部擴展；pse(t)的特點是在苗期無表型，抽穗期首先在老葉上出現褐色斑點，接著整片葉子快速黃化衰老，之后葉鞘和上部葉片也開始黃化衰老，至乳熟期大部分葉片衰老枯萎；esl2孕穗期開始才從葉尖和葉緣部逐漸黃化衰老；es-t在苗期葉片就開始變黃，且有銹斑出現，其中，葉緣和葉尖表型更嚴重。esl3三葉期前表型不明顯，三葉期后葉片發育完全后新葉葉尖表現褐化死亡，該性狀一直持續到成熟；lad葉尖在第5片葉抽出前呈正常狀態，當第5片葉完全抽出之后前5葉的葉尖變黃并最終枯死；此后新葉在完全抽出后葉尖也逐漸變黃并枯死。本研究中es5葉片中SOD活力和MDA含量較野生型顯著性升高，可溶性蛋白含量較野生型顯著性降低。es5葉片中促進衰老的基因Osh36、Osh69、OsI85、RCCR1和葉綠素降解相關基因SGR表達量極顯著上調。es5葉片中葉綠體降解加速，野生型葉綠體結構正常。推測由于ES5的突變致使早衰相關基因和葉綠體降解相關基因被激活高量表達導致突變體內葉綠體降解加速，光合色素含量降低，光合能力下降，導致es5葉片黃化植株過早衰老，產量下降。

表4 水稻中已定位早衰相關基因在染色體上的位置Table 4 The location of genes about leaf senescence on chromosomes in rice

遺傳分析和基因精細定位發現es5受單隱性核基因控制，該基因位于第 5染色體標記 4BF-10和RM3664之間約52.7 kb區域內，該定位區間包含8個ORFs。ORF1 和 ORF3 編碼轉座子蛋白；ORF2、ORF4、ORF5和ORF6編碼未知表達蛋白；ORF7編碼生長素響應 Aux/IAA家族基因OsIAA19；ORF8編碼糖基轉移酶43家族蛋白。生長素可以直接延緩植物的衰老[56]。糖基化修飾可以改變生物活性、水溶性、在植物體內的轉運特性、亞細胞定位以及與受體的識別與結合的特性，而且還能降低或消除內源和外源物質的毒性。而糖基轉移酶是一種專門進行糖基化修飾的酶類。因此，糖基轉移酶在調節植物的代謝、維持植物體的正常生長等方面具有重要的意義[57]。將ORF7或ORF8暫定為可能的候選基因，優先對其進行序列分析。

自然衰老過程中伴隨各種營養物質和代謝產物成分的變化。在衰老過程中植物體內的營養物質再分配到生殖器官等代謝旺盛的部位，便于營養物質的再利用，有利于植物的生長繁殖，是植物長期進化過程中形成的一種適應性。正常的、適時的衰老對植物生長發育而言是有利的，但過早衰老會導致作物產量和品質下降[58]。因此分離更多的水稻早衰相關基因并闡明其生物學功能，從而有效促進水稻葉片衰老調控分子機制的研究，對于穩定水稻產量提高水稻品質具有重要意義。本研究已完成對 ES5的精細定位，為克隆該基因以及深入研究該基因的功能奠定了堅實的基礎。

4 結論

es5表現出光合色素含量降低，光合能力下降，植株變矮，單株有效分蘗數減少，千粒重和結實率等顯著下降。es5受1對隱性核基因控制，并將該基因定位在第 5染色體介于標記 4BF-10和 RM3664之間52.7 kb的區域內。推測ES5是一個新的早衰調控基因。

[1] YOSHIDA S. Molecular regulation of leaf senescence. Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6(1): 79-84.

[2] WU Z M, ZHANG X, HE B, SHENG S L, WANG J L, GUO X P, SU N, WANG L F, JIANG L, WANG C M, ZHAI H Q, WAN J M. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiology, 2007,145(1): 29-40.

[3] SEO P J, XIANG F N, QIAO M, PARK J Y, LEE Y N, KIM S G, LEE Y H, PARK W J, PARK C M. The MYB96 transcription factor mediates abscisic acid signaling during drought stress response in Arabidopsis. Plant Physiology, 2009, 151(1): 275-289.

[4] NAVABPOUR S, MORRIS K, ALLEN R, HARRISON E,A-H-MACKERNESS S, BUCHANAN-WOLLASTON V. Expression of senescence-enhanced genes in response to oxidative stress. Journal of Experimental Botany, 2003. 54(391): 2285-2292.

[5] JIANG C Z, RODERMEL S R, SHIBLES R M. Photosynthesis,rubisco activity and amount, and their regulation by transcription in senescing soybean leaves. Plant Physiology, 1993, 101(1): 105-112.

[6] LIU L, ZHOU Y, SZCZERBA M W, LI X H, LIN Y J. Identification and application of a rice senescence-associated promoter. Plant Physiology, 2010, 153(3): 1239.

[7] LIU L, ZHOU Y, ZHOU G, YE R J, ZHAO L N, LI X H, LIN Y J.Identification of early senescence-associated genes in rice flag leaves.Plant Molecular Biology, 2008, 67(1/2): 37.

[8] KUSABA M, ITO H, MORITA R, IIDA S, SATO Y, FUJIMOTO M,KAWASAKI S,TANAKA R, HIROCHIKA H, NISHIMURA M,TANAKA A. Rice NON-YELLOW COLORING1 is involved in light-harvesting complex II and grana degradation during leaf senescence. The Plant Cell, 2007, 19(4): 1362-1375.

[9] JIAO B B, WANG J J, ZHU X D, ZENG L J, LI Q, HE Z H. A novel protein RLS1 with NB-ARM domains is involved in chloroplast degradation during leaf senescence in rice. Molecular Plant, 2012,5(1): 205.

[10] TANG Y Y, LI M R, CHEN Y P, WU P Z, WU G J, JIANG H W.Knockdown of Os PAO, and Os RCCR1, cause different plant death phenotypes in rice. Journal of Plant Physiology, 2011, 168(16):1952-1959.

[11] YAMATANI H, SATO Y, MASUDA Y, KATO Y, MORITA R,FUKUNAGA K, NAGAMURA Y, NISHIMURA M, SAKAMOTO W,TANAKA A, KUSABA M. NYC4, the rice ortholog of Arabidopsis THF1, is involved in the degradation of chlorophyll-protein complexes during leaf senescence. The Plant Journal, 2013, 74(4):652-662.

[12] MORITA R, SATO Y, MASUDA Y, NISHIMURA M, KUSABA M.Defect in non-yellow coloring 3, an α/β hydrolase-fold family protein, causes a stay-green phenotype during leaf senescence in rice.Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2009, 59(6): 940-952.

[13] LEE R H, LIN M C, CHEN S C G. A novel alkaline α-galactosidase gene is involved in rice leaf senescence. Plant Molecular Biology,2004, 55(2): 281-295.

[14] JIANG H W, LI M R, LIANG N T, YAN H B, WEI Y B, XU X L,LIU J, XU Z F, CHEN F, WU G J. Molecular cloning and function analysis of the stay green gene in rice. The Plant Journal, 2007, 52(2):197-209.

[15] PARK S Y, YU J W, PARK J S, LI J J, YOO S C, LEE N Y, LEE S K,JEONG S W, SEO H S, KOH H J, JEON J S, PARK Y, PAEK N C.The senescence-induced stay green protein regulates chlorophyll degradation. The Plant Cell Online, 2007, 19(5): 1649-1664.

[16] WU H B, WANG B, CHEN Y L, LIU Y G, CHEN L T.Characterization and fine mapping of the rice premature senescence mutant ospse1. Theoretical and Applied Genetics, 2013, 126(7): 1897.

[17] ZHOU Y, LIU L, HUANG W, YUAN M, ZHOU F, LI X, LIN Y.Overexpression of OsSWEET5 in rice causes growth retardation and precocious senescence. PLoS ONE, 2014, 9(4): e94210.

[18] 孫玉瑩. 水稻葉片早衰基因PSL2的圖位克隆及功能初步分析[D].北京: 中國農業科學院, 2013.SUN Y Y. Map-based cloning and basic functional analysis of presenescing leaf gene PSL2 in rice (Orzya sativa L.)[D]. Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013. (in Chinese)

[19] KONG Z, LI M N, YANG W Q, XU W Y, XUE Y B. A novel nuclear-localized CCCH-type zinc finger protein, OsDOS, is involved in delaying leaf senescence in rice. Plant Physiology, 2006, 141(4):1376-1388.

[20] CHEN Y, XU Y Y, LUO W, LI W X, CHEN N, ZHANG D J, CHONG K. The F-box protein OsFBK12 targets OsSAMS1 for degradation and affects pleiotropic phenotypes, including leaf senescence, in rice.Plant Physiology, 2013, 163(4): 1673.

[21] QIAO Y L, JIANG W Z, LEE J H, PARK M S, PIAO R H, WOO M O, ROH J H, HAN L Z, PAEK N C, SEO H S, KOH H J. SPL28 encodes a clathrin-associated adaptor protein complex 1, medium subunit μ1(AP1M1) and is responsible for spotted leaf and early senescence in rice (Oryza sativa L.). New Phytologist, 2010, 185(1):258-274.

[22] WANG S, LEI C L, WANG J L, MA J, TANG S, WANG C L, ZHAO K J, TIAN P, ZHANG H, QI C Y, CHENG Z J, ZHANG X, GUO X P,LIU L L, WU C Y, WAN J M. SPL33, encoding an eEF1A-like protein,negatively regulates cell death and defense responses in rice. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(5): 899-913.

[23] UNDAN J R, TAMIRU M, ABE A, YOSHIDA K, KOSUGI S,TAKAGI H, YOSHIDA K, KANZAKI H, SAITOH H, FEKIH R,SHARMA S, UNDAN J, YANO M, TERAUCHI R. Mutation in OsLMS, a gene encoding a protein with two double-stranded RNA binding motifs, causes lesion mimic phenotype and early senescence in rice (Oryza sativa L.). Genes & Genetic Systems, 2012, 87(3): 169.

[24] HUANG Q N, SHI Y F, ZHANG X B, SONG L X, FENG B H,WANG H M, XU X, LI X H, GUO D, WU J L. Single base substitution in OsCDC48 is responsible for premature senescence and death phenotype in rice. Journal of Integrative Plant Biology, 2016,58(1): 12.

[25] LIN Y H, TAN L B, ZHAO L, SUN X Y, SUN C Q. RSL3, a protein with AAA+ domain localized in chloroplast, sustains leaf longevity in rice. Journal of Integrative Plant Biology, 2016, 58(12): 971-982.

[26] ANSARI M I, LEE R H, CHEN S C G. A novel senescence-associated gene encoding γ-aminobutyric acid (GABA): Pyruvate transaminase is upregulated during rice leaf senescence. Physiologia Plantarum,2005,123(1): 1-8.

[27] BI Z Z, ZHANG Y X, WU W X, ZHAN X D, YU N, XU T T, LIU Q E, LI Z, SHEN X H, CHEN D B, CHENG S H, CAO L Y. Es7,encoding a ferredoxin-dependent glutamate synthase, functions in nitrogen metabolism and impacts leaf senescence in rice. Plant Science An International Journal of Experimental Plant Biology, 2017,259: 24.

[28] SUN L T, WANG Y H, LIU L L, WANG C M, GAN T, ZHANG Z Y,WANG Y L, WANG D, NIU M, LONG W H, LI X H, ZHENG M,JIANG L, WAN J M. Isolation and characterization of a spotted leaf 32 mutant with early leaf senescence and enhanced defense response in rice. Scientific Reports, 2017, 7: 41846.

[29] 王兆海. 水稻類病變相關基因SPL29的克隆和功能研究[D]. 武漢:武漢大學, 2014.WANG Z H. Cloning and functional analysis of the rice lesion-mimic associated gene SPL29[D]. Wuhan: Wuhan University, 2014. (in Chinese)

[30] WANG J, WU S, ZHOU Y, ZHOU L H, XU J F, JING H, FANG Y X,GU M H, LIANG G H. Genetic analysis and molecular mapping of a presenescing leaf gene psl1 in rice (Oryza sativa L.). Chinese Science Bulletin, 2006, 51(24): 2986-2992.

[31] 肖銳. 兩個水稻早衰突變體的遺傳分析與基因定位[D]. 雅安: 四川農業大學, 2012.XIAO R. Genetic Analysis and Gene Mapping of two early senescence Mutants in Rice[D].Yaan: Sichuan Agricultural University,2012. (in Chinese)

[32] 孫惠敏, 潘剛, 潘曉華, 程方民, 黃福燈, 李保同, 張春嬌, 毛節景,趙晨晨. 水稻早衰突變體 lst的生理分析與基因定位. 核農學報,2014, 28(3): 404-411.SUN H M, PAN G, PAN X H, CHENG F M, HUANG F D, LI B T,ZHANG C J, MAO J J, ZHAO C C. Physiological analysis and gene mapping of rice premature mutant lst. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2014, 28(3): 404-411. (in Chinese)

[33] 桑賢春, 徐芳芳, 朱小燕, 邢亞迪, 何沛龍, 張長偉, 楊正林, 何光華. 水稻早衰突變體 esl5的鑒定及其基因精細定位. 作物學報,2014, 40(7): 1182-1189.SANG X C, XU F F, ZHU X Y, XING Y D, HE P L, ZHANG C W,YANG Z L, HE G H. Identification and gene fine mapping of early senescent leaf mutant esl5 in Oryza sativa. Acta Agronomica Sinica,2014, 40(7): 1182-1189. (in Chinese)

[34] 徐芳芳, 桑賢春, 任德勇, 唐彥強, 胡宏偉, 楊正林, 趙芳明, 何光華. 水稻早衰突變體esl2 的遺傳分析及基因定位. 作物學報, 2012.38(8): 1347-1353.XU F F, SANG X C, REN D Y, TANG Y Q, HU H W, YANG Z L,ZHAO F M, HE G H. Genetic analysis and gene mapping of early senescence leaf mutant esl2 in rice. Acta Agronomica Sinica, 2012,38(8): 1347-1353. (in Chinese)

[35] DENG L C, QIN P, LIU Z, WANG G L, CHEN W L, TONG J H,XIAO L T, TU B, SUN Y T, YAN W, HE H, TAN J, CHEN X W,WANG Y P, LI S G, MA B T. Characterization and fine-mapping of a novel premature leaf senescence mutant yellow leaf and dwarf 1 in rice. Plant Physiology Biochemistry, 2017, 111: 50-58.

[36] FANG L K, LI Y F, GONG X P, SANG X C, LING Y H, WANG X W,GONG Y F, HE G H. Genetic analysis and gene mapping of a dominant presenescing leaf gene PSL3 in rice (Oryza sativa L.).Chinese Science Bulletin, 2010, 55(23): 2517-2521.

[37] LI F Z, HU G C, FU Y P, BAI X M, SUN Z X. Genetic analysis and high-resolution mapping of a premature senescence gene Pse(t) in rice(Oryza sativa L.). Genome, 2005, 48(4): 738-746.

[38] YAN W Y, YE S H, JIN Q S, ZENG L J, PENG Y, YAN D W, YANG W B, YANG D L, HE Z H, DONG Y J, ZHANG X M.Characterization and mapping of a novel mutant sms1 (senescence and male sterility 1) in rice. Genet Genomics, 2010, 37: 47-55.

[39] 楊波, 夏敏, 張孝波, 王曉雯, 朱小燕, 何沛龍, 何光華, 桑賢春.水稻早衰突變體 esl6的鑒定與基因定位. 作物學報, 2016,42(7):976-983.YANG B, XIA M, ZHANG X B, WANG X W, ZHU X Y, HE P L, HE G H, SANG X C. Identification and gene mapping of an early senescent leaf mutant esl6 in Oryza sativa L.. Acta Agronomica Sinica,2016, 42(7): 976-983. (in Chinese)

[40] 孫煥明. 水稻蒼白葉突變體 pgl3(t)的遺傳分析和基因定位[D]. 揚州: 揚州大學, 2008.SUN H M. Genetic analysis and fine mapping of pgl3(t)mutant in rice[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2008. (in Chinese)

[41] 冷語佳. 水稻早衰基因ES10的遺傳分析與基因定位[D]. 北京: 中國農業科學院, 2013.LENG Y J. Genetic analysis and fine mapping of ES10 in rice (Oryza sativa L.) [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences,2013. (in Chinese)

[42] 杜青, 方立魁, 桑賢春, 凌英華, 李云峰, 楊正林, 何光華, 趙芳明. 水稻葉尖早衰突變體lad的形態、生理分析與基因定位. 作物學報, 2012, 38(1): 168-173.DU Q, FANG L K, SANG X C, LING Y H, LI Y F, YANG Z L, HE G H, ZHAO F M. Analysis of phenotype and physiology of leaf apex dead mutant (lad) in rice and mapping of mutant gene. Acta Agronomica Sinica, 2012, 38(1): 168-173. (in Chinese)

[43] JAN A, MARUYAMA K, TODAKA D, KIDOKORO S, ABO M,YOSHIMURA E, SHINOZAKI K, NAKASHIMA K, YAMAGUCHISHINOZAKI K. OsTZF1, a CCCH-tandem zinc finger protein,confers delayed senescence and stress tolerance in rice by regulating stress-related genes. Plant Physiology, 2013, 161(3): 1202-1216.

[44] PITAKRATTANANUKOOL S, KAWAKATSU T, ANUNTALABHOCHAI S, TAKAIWA F. Overexpression of OsRab7B3, a small GTP-binding protein gene, enhances leaf senescence in transgenic rice. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2012, 76(7): 1296-1302.

[45] 苗潤隆, 蔣鈺東, 廖紅香, 徐芳芳, 何光華, 楊正林, 趙芳明, 桑賢春. 水稻早衰突變esl3的鑒定與基因定位. 作物學報, 2013, 39(5):862-867.MIAO R L, JIANG Y D, LIAO H X, XU F F, HE G H, YANG Z L,ZHAO F M, SANG X C. Identification and gene mapping of rice early senescent leaf (esl3) mutant. Acta Agronomica Sinica, 2013,39(5): 862-867. (in Chinese)

[46] YANG Y L, RAO Y C, LIU H J, FANG Y X, DONG G J, HUANG L C, LENG Y J, GUO L B, ZHANG G H, HU J, GAO Z Y, QIAN Q,ZENG D L. Characterization and fine mapping of an early senescence mutant (es-t) in Oryza sativa L.. Chinese Science Bulletin, 2011,56(23): 2437-2443.

[47] THORDAL-CHRISTENSEN H, ZHANG Z G, WEI Y D, COLLINGE D B. Subcellular localization of H2O2in plants. H2O2accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. The Plant Journal, 1997, 11(6): 1187-1194.

[48] KONG X, LI D. Hydrogen peroxide is not involved in HrpN from Erwinia amylovora-induced hypersensitive cell death in maize leaves.The Plant Cell Reports, 2011, 30(7): 1273-1279.

[49] LI Y, GAO Y, XU X, SHEN Q, GUO S. Light-saturated photosynthetic rate in high-nitrogen rice (Oryza sativa L.) leaves is related to chloroplastic CO2concentration. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(8): 2351.

[50] SCHIPPERS J H, SCHMIDT R, WAGSTAFF C, JING H C. Living to die and dying to live: The survival strategy behind leaf senescence.Plant Physiology, 2015, 169(2): 914.

[51] ARNON D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. polyphenoloxidase in beta vulgaris. Plant Physiology, 1949, 24(1): 1-15.

[52] PORRA R J, SCHAFER W, CMIEL E, KATHEDER I, SCHEER H.The derivation of the formyl-group oxygen of chlorophyll b in higher plants from molecular oxygen, Aspects of internalization. FEBS Journal,2010, 219(1/2): 671-679.

[53] 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術. 第一版. 北京: 高等教育出版社, 2000: 184-261.LI H S. Principles and Techniques of Plant Physiological and Biochemical Experiment. The Front Page. Beijing: Higher Education Press, 2000: 184-261. (in Chinese)

[54] ROGERS S O, BENDICH A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, 1985, 5(2): 69-76.

[55] LEE R H, WANG C H, HUANG L T, CHEN S C G. Leaf senescence in rice plants: Cloning and characterization of senescence up-regulated genes. Journal of Experimental Botany, 2001, 52(358): 1117.

[56] XU Y, GIANFAGNA T, HUANG B R. Proteomic changes associated with expression of a gene (ipt) controlling cytokinin synthesis for improving heat tolerance in a perennial grass species. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(12): 3273.

[57] 吳新新. 激素相關的糖基轉移酶基因克隆及轉基因水稻培育[D].濟南: 山東大學, 2014.WU X X. Gene cloning of glucosyltransferases of plant hormones and cultivation of transgenic rice[D]. Jinan: Shandong University, 2014.(in Chinese)

[58] 段俊, 梁承鄴, 黃毓文. 雜交水稻開花結實期間葉片衰老. 植物生理學報, 1997, 2(2): 139-144.DUAN J, LIANG C Y, HUANG Y W. Studies on leaf senescence of hybrid rice at flowering and grain formation stage. Plant Physiology Journal, 1997, 2(2): 139-144. (in Chinese)