以血細胞分析為例淺談醫學參考測量實驗室的建立

康 娟， 王會如， 孫京昇， 王 軍， 陳 微

（北京市醫療器械檢驗所 醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京 101111）

臨床檢驗在醫學診療中發揮著越來越重要的作用，迫切要求不同時間、不同實驗室之間的檢驗結果具有可比性。量值溯源是實現檢驗結果準確可比的重要手段。1998年，歐盟發布了體外診斷器具指令Directive 98/79/EC，對體外診斷產品的量值溯源性提出了強制要求，并相繼推出ISO 17511、ISO 15195等系列配套國際標準[1-5]。國際檢驗醫學溯源聯合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）的成立，旨在協調該領域參考物質、參考測量程序、參考測量實驗室基標準資源的建立。醫學參考測量實驗室作為實施參考測量程序并提供帶有規定不確定度結果的實驗室非常重要。中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）在借鑒國際經驗的基礎上發布了參考測量實驗室的認可要求[6]，從2011年開始正式受理我國醫學參考測量實驗室的認可工作。迄今為止已認可9家實驗室，涉及血細胞分析、酶學、代謝物和蛋白質分析等領域。和檢測實驗室相比，參考測量實驗室對量值溯源和質量保證有更高的要求。醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室從2007年開始著手建立血細胞分析參考測量實驗室，2013年正式獲得CNAS認可[7]。本文以血細胞分析為例，著重圍繞量值溯源、質量控制、質量管理體系3個方面來討論，以期對醫學參考測量實驗室的建立工作起到拋磚引玉的作用。

1 量值溯源

檢驗醫學領域參考測量實驗室的工作條件必須保證其提供的結果可以溯源至現有的最高級計量學等級，并應保證其提供的計量服務可滿足醫學要求[6]，這就需要建立參考測量程序以溯源到最高標準，進行儀器的檢定和校準以保證量值傳遞的可靠性，并開展不確定度評估確認所提供的計量服務的有效性。

1.1 參考測量程序的建立

如圖1所示，國際約定參考測量程序是血細胞分析量值溯源的起點，經由新鮮血完成量值傳遞，而新鮮血只能穩定數小時，這就要求建立參考測量實驗室持續運行參考方法。醫療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室依照國際血液學標準化委員會（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）、美國臨床和實驗室標準協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）等標準化組織發布的國際約定參考方法[8-13]，建立了紅細胞（red blood cell，RBC）計數、白細胞（white blood cell，WBC）計數、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血細胞比容（hematocrit，HCT）、血小板（platelet，PLT）計數5個項目的參考測量程序[7]。RBC計數、WBC計數參考方法用半自動電阻抗粒子計數儀測定固定體積溶液中的細胞數，Hb參考方法測定溶解RBC中Hb轉化成氰化高鐵血紅蛋白的吸光度（A）值，HCT參考方法采用微量毛細管測定離心后的RBC體積在全血體積中所占的比例，PLT計數參考方法用流式細胞儀間接計數。

方法建立過程中，一方面要選擇符合參考方法要求的試劑及設備，包括稀釋液、溶血劑、文齊氏液、熒光標記抗體等試劑，以及半自動電阻抗粒子計數儀、流式細胞儀、分光光度計、離心機等設備，容量瓶、比色池、毛細管等。參考方法中手工操作步驟多，對血液樣本的準確稀釋非常關鍵，我們選用固定體積的柱塞式移液器移取微量血液樣本，并用重量法對移取體積進行校準；另一方面要梳理參考方法中的關鍵要素并進行優化，包括對RBC計數和WBC計數的計數時間、溶血條件、重合校正等條件的摸索，HCT測定的離心條件、讀線位置的確認，Hb濃度測量時溶血時間的確認，PLT計數時熒光標記步驟、標記時間和測定流速等條件的摸索，建立起具有操作性和科學性的參考測量程序。

圖1 血細胞分析量值溯源圖

1.2 儀器校核

儀器校核對于縮小實驗誤差、保證結果可靠至關重要。同時，儀器校核結果也是下一步不確定度評定的重要依據。我們制定了血細胞分析參考測量程序所涉及的主要設備的操作維護規程和校準檢定計劃，并授權專人進行定期檢查和維護。校準檢定計劃要覆蓋主要設備和關鍵性能，采用檢定、內外部校準、期間核查、室內質控等一種或多種方式來保證設備精度符合參考方法要求。如RBC計數及WBC計數所用的半自動電阻抗粒子計數儀，由廠家定期校準其計數體積，測試國內標準物質進行驗證，同時每2周測試膠乳顆粒質控物（Cellcheck-400）1次來監測儀器硬件的穩定性；又如Hb濃度測量中分光光度計采用了定期檢定和期間核查相結合的方式來校核。

1.3 不確定度評估

參考測量實驗室必須提供帶有規定不確定度的結果，要求正確評估不確定度，并確保不確定度在適宜范圍內以滿足質量要求。CNAS的相關應用準則[14-17]明確了對溯源性、不確定度和內部校準的要求，文獻[18-19]詳細說明了不確定度評定的方法。

分析血細胞分析各個項目參考測量程序的操作步驟，依據數學模型建立起不確定度評定方程，依次分析和評估各個不確定度分量，再按照不確定度傳播率合成得到總不確定度（U）。以Hb參考測量程序為例，Hb濃度的計算公式為：C=（A540×16 114.5×F）/（11.0×d×1 000）（式中C為Hb濃度，F為稀釋倍數，d為比色池光徑）。經分析，該結果的不確定度主要由重復測量引起的不確定度（uR）、A值測量相關的不確定度（uA）、比色杯光徑相關的不確定度（ud）、微量移液器體積相關的不確定度（uD）和容量瓶體積相關的不確定度（uF）組成，將換算后的各個分量標準的不確定度合成得到合成不確定度（uc），公式為：=1.29 g/L，最終得到擴展不確定度（總不確定度）U=2.3 g/L（擴展因子k=2），見表1。

需要特別指出的是“校準和測量能力（calibration and measurement capability，CMC）”的概念，CNAS-CL07：2011《測量不確定度的要求》[14]和CNAS-GL37：2015《校準和測量能力（CMC）表示指南》[20]對此作了專門的規定。CMC是校準實驗室在常規條件下的校準中可獲得的最小測量不確定度，當被測量的值是一個范圍時，CMC可視情況用單一值、范圍、被測量值或參數的函數、矩陣等一種或多種方式來表示。為此，本研究基于2012—2015年的試驗數據，考察了各個血細胞分析參考測量程序各主要不確定度分量在測量濃度范圍內的分布在（125～175）g/L濃度范圍內，重復測量引起的相對不確定度分量UR，rel與Hb濃度沒有表現出明顯相關性，可用多份血樣的合并標準差這種單一值形式來表示該不確定度分量（圖2）。經綜合分析，最終用單一值來表示各個血細胞分析各項目參考測量程序的CMC（表2）。

表1 Hb參考測量程序不確定度評估

圖2 重復測量引起的相對不確定度與Hb濃度的相關圖

2 質量控制

醫學參考測量實驗室應針對客戶需求和計量學水平確定分析目標，建立行之有效的質量控制規則，并使用與臨床樣本基質相似的質控物，在內部質控的基礎上定期參加實驗室間的比對，核查運行情況。本實驗室結合血細胞分析參考方法的特點開展了一系列質量控制活動。

2.1 室內比對

為了在6 h內完成對多份新鮮血樣本的測定，我們安排了多名技術人員。同一項目至少有2名操作人員可以獨立操作，以保證實驗室各項工作的穩定開展。同時定期檢驗單人操作的重復性和人員間測定的相對偏差，確保其在規定范圍內。除此之外，還開展了微量移液器、分光光度計等設備精度比對及PLT計數的方法學比對等。

表2 血細胞分析各項目參考測量實驗室校準和測量能力

2.2 室內質控

作為一級標準器的粒子計數儀，每周用全血質控物（Eightcheck-3WP）測定2次以監測RBC計數和WBC計數參考方法的穩定性；作為二級標準器的血液分析儀每周用多水平全血質控物（e-check）測定2次以監測儀器的穩定性。考慮到質控實施的頻次，為了更快、更靈敏地發現問題，我們主要采用12s/13s/22s/R4s作為質控規則。控制限采用前3個批號質控品的總變異系數（coefficient of variation，CV），新批號的靶值則是3 d內至少10個測試數據的平均值，賦值前先用舊批號確認測試系統狀態。

2.3 室間比對

室內比對和室內質控只保證了測量系統的重復性和穩定性，為了驗證測量結果的正確性，需要積極尋求外部比對。由于國內外尚沒有血細胞分析參考方法的能力驗證計劃，我們一方面與我國和日本、美國、德國的全球參考實驗室通過定期測試同一批號的質控血樣本，開展RBC計數、WBC計數、HCT和Hb參考方法的比對；另一方面與國內血細胞分析參考測量實驗室如衛生部臨床檢驗中心血液實驗室、深圳邁瑞股份有限公司標準化實驗室等進行新鮮血定值比對。各項目的比對結果良好，只有PLT計數項目在第1次新鮮血比對中結果偏高，在查找原因調試后得到了糾正，之后的比對結果均在規定偏差范圍內，證明所建立的參考方法準確、可靠。見圖3。

作為二級標準器的血液分析儀在加入廠家在線質控系統的同時，參加了衛生部臨床檢驗中心組織的全國室間質評和正確度驗證計劃。

3 質量管理體系

建立質量管理體系是規范協調“人、機、料、法、環”各相關質量要素，全面、系統地實現質量管理的有效途徑。CNAS制定了相關的認可要求來指導醫學參考測量實驗室質量體系的建立，其中CNAS-CL32：2011《檢驗醫學領域參考測量實驗室的特定認可要求》[6]、CNASCL01：2006《檢測和校準實驗室能力認可準則》[21]、CNAS-CL52 2014《CNAS-CL01〈檢測和校準實驗室能力認可準則〉應用要求》[22]共同作為醫學參考測量實驗室質量體系的認可要求，其他系列應用指南[23-25]針對血細胞分析、酶學等具體領域作了細致的說明。

我們圍繞參考測量實驗室質量管理體系的建立做了幾項工作：結合實際確定了質量方針和近期質量目標；梳理實現測量服務全過程的質量環節，明確和完善體系結構，在北京市醫療器械檢驗所原有ISO/IEC 17025：2005檢驗實驗室質量管理體系的基礎上搭建了相對獨立的參考測量實驗室質量體系，建立了由1份質量手冊、34個程序文件、近百個作業指導書和工作表格等組成的體系文件；在體系范圍內有效宣貫和實施這些文件，以“可靠測量”為核心，努力做到“寫我能做的，做我所寫的，記我所做的”；定期進行質量體系審核，從2012年體系運行以來每年至少組織1次內審和管理評審，在2013年取得參考測量實驗室資質后，又按CNAS-RL01：2016《實驗室認可規則》[26]的要求陸續接受了CNAS組織的監督評審和復評審各1次。值得一提的是，建立質量管理體系是一個不斷發現和解決問題的動態過程，需要持續的投入才能在更高層次上健全管理體系。

4 結語

醫學參考測量實驗室對技術能力和質量管理的要求較高，目前國內相關資源仍比較缺乏。一方面應積極協調針對緊缺項目的參考測量方法和參考測量實驗室的建立，充分借鑒國內外經驗，調動各個主體尤其是體外診斷產品制造商在標準化過程中的積極性；另一方面應充分發揮現有醫學參考測量實驗室的校準能力，積極滿足客戶多層次的產品量值溯源需求，包括為體外診斷產品制造商提供校準服務，為產品監督管理部門提供質量評價標準，為能力驗證等室間比對活動提供賦值樣本，全面促進臨床檢驗結果的準確可比。這些成果的廣泛建立和有力推廣必將在很大程度上解決體外診斷領域存在的產品無源可溯、監管無據可依的難題，提升整個產業的標準化水平。

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