異性骨髓移植后無精癥患者Y染色體的檢測

胡 瑩， 梁先念， 于建紅， 覃凌云， 王玉明

（1.昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南 昆明 650101；2.昆明醫科大學第二附屬醫院男性科，云南 昆明 650101）

10%～15%的精子缺陷和男性不育是由遺傳因素引起的，其中Y染色體AZF區微缺失是引起精子缺陷和男性不育的主要遺傳因素之一。外周血染色體核型分析合并Y染色體AZF區微缺失檢測對臨床醫師選擇不同的輔助生殖技術和避免父代遺傳基因缺陷有著重要的意義。然而，不同性別供者、受者之間進行骨髓移植，會形成穩定的嵌合體，染色體相關檢測結果表現為供者型。本研究報道異性骨髓移植后無精癥患者1例，其外周血Y染色體AZF區微缺失檢測和染色體核型分析結果均顯示無Y染色體，但口腔黏膜拭子Y染色體AZF區微缺失檢測結果顯示AZF區位點均存在。臨床應對異性骨髓移植后無精癥患者的外周血Y染色體AZF區微缺失檢測結果加以重視。

1 材料和方法

1.1 研究對象

患者，男，33 歲，因無精癥來昆明醫科大學第二附屬醫院就診。該患者于2000年確診為慢性粒細胞性白血病。2001年在北京大學第一醫院行骨髓干細胞移植術，供者為患者姐姐，術后恢復良好。2015年2月在昆明醫科大學第二附屬醫院行精液常規檢查，檢查結果顯示精子總數為0，且對精液高速離心后沉渣鏡檢也未見精子。睪丸彩色多普勒超聲提示右側睪丸大小為38 mm×22 mm×16 mm，體積為8.6 cm3；左側睪丸大小為38 mm×21 mm×15 mm，體積為8.4 cm3。雙側睪丸體積偏小。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色體核型分析 采集該患者外周血0.8 mL，運用肝素進行抗凝處理，置于淋巴細胞培養液中，恒溫37 ℃培養72 h。收獲前1小時加入秋水仙素，常規收獲細胞，制片，G顯帶，分析 3～5個分裂相，計數20個核型，參照人類細胞遺傳學國際命名體制（an International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）（2005）[1]進行外周血染色體核型描述。

1.2.2 外周血Y染色體AZF區微缺失檢測 采集該患者外周血3.0 mL，運用乙二胺四乙酸進行抗凝處理，運用多重聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）（北京愛普益生物科技有限公司人Y染色體AZF區微缺失核酸檢測試劑盒）檢測外周血Y染色體AZF區的8個序列標記位點（sequence-tagged site，STS）（AZFa區：sy84、sy86；AZFb區：sy127、sy134；AZFc區：sy254、sy255；AZFd區：sy145、sy152）。設正常男性為陽性對照，設正常女性為陰性對照。PCR 反應條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃1 min，4個循環；94 ℃ 15 s，56 ℃ 1 min，45個循環。運用2%瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測。

1.2.3 口腔黏膜拭子Y染色體AZF區微缺失檢測 采集該患者口腔黏膜拭子樣本，1 mL三羥甲基氨基甲烷緩沖液震蕩，高速離心，將所有沉淀富集到離心管中，提取DNA后進行口腔黏膜拭子Y染色體AZF區微缺失檢測。

1.2.4 血清生殖激素檢測 采用ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析系統（化學發光法）及配套試劑（美國雅培公司）檢測血清泌乳素、卵泡刺激素、黃體生成素、雌二醇、孕酮、睪酮水平。

2 結果

2.1 外周血染色體核型分析結果

該患者外周血染色體核型分析結果為46xx。見圖1。

圖1 外周血染色體核型分析結果

2.2 外周血Y染色體AZF區微缺失檢測結果

外周血Y染色體AZF區的8個STS均缺失，且Y染色體性別決定基因（sex-determining region Y，SRY）無擴增曲線。

2.3 口腔黏膜拭子Y染色體AZF區微缺失檢測結果

口腔黏膜拭子Y染色體AZF區的8個STS均存在，且SRY均擴增到曲線。多重PCR擴增產物電泳結果見圖2。

圖2 Y染色體AZF區微缺失多重PCR擴增產物電泳圖

2.4 血清生殖激素檢測結果

該患者卵泡刺激素及孕酮水平均升高。卵泡刺激素水平為15.88 IU/L（參考區間為0.95～11.8 IU/L）；孕酮水平為0.84 nmol/L（參考區間為＜0.64 nmol/L）。該患者血清泌乳素水平為169.07 mIU/L（參考區間為72.66～407.40 mIU/L）；黃體生成素水平為6.23 IU/L（參考區間為0.57～12.07 IU/L）；雌二醇水平為90.12 pmol/L（參考區間為40.37～161.48 pmol/L）；睪酮水平為24.66 nmol/L（參考區間為4.94～32.01 nmol/L）。

3 討論

遺傳學異常是臨床上導致男性不育的重要因素。隨著生殖醫學及男科學的不斷發展，很多既往認為只能供精輔助生育的患者，可能可以通過睪丸顯微取精術，行輔助生殖技術來助孕[2]。因此，遺傳學檢查對男性生殖疾病診治來說越來越重要，其對指導臨床治療、提高輔助生殖技術的療效和安全性、開展胚胎植入前遺傳學診斷等方面都有著重要的意義。

染色體核型分析是最常用的男性生殖遺傳學檢查，男性染色體核型異常會導致不育[3]，Y染色體微缺失是導致無精癥和嚴重少精癥的一個重要遺傳因素。在無精癥和少精癥患者中，AZF區微缺失的情況占3%～29%，其發生率僅次于Klinefelter綜合征[4]。建議對非梗阻性無精癥、嚴重少精癥患者行Y染色體微缺失檢測[5]。對原因不明的男性不育患者，可選擇行Y染色體微缺失檢測[6-7]。AZF區微缺失可垂直遺傳，故建議有相關家族史者進行AZF區微缺失篩查[8]。

骨髓移植是在破壞受者造血系統的基礎上，輸入供者的骨髓細胞，使供者細胞在受者體內生長，受者造血系統得以重建。骨髓移植成功與否，與供者細胞在受者體內的植入狀態，即與供者嵌合狀態的建立和發展有關。當供者骨髓細胞完全占據受者的骨髓或外周血，即供者細胞完全植入時，為完全嵌合狀態。如果供者為女性，受者為男性，可通過檢測供者的Y染色體，來確定嵌合狀態。

本研究中患者因無精癥前來就診，并行Y染色體微缺失檢查。外周血Y染色體AZF區微缺失檢測結果顯示SRY無擴增，建議作外周血染色體核型分析，結果為46xx。通過對該患者病史進行詳細詢問，得知患者在十余年前進行了異性骨髓移植，可能為移植后嵌合狀態。故采集患者口腔黏膜拭子樣本進行Y染色體AZF區微缺失檢測，結果為AZF區位點均存在。基本排除該患者無精癥的病因為Y染色體AZF區微缺失的可能。無精癥是否和患者行骨髓移植使用大劑量化療藥物有關，患者雙側睪丸體積偏小，是否與遺傳性無精癥有關，均需進行下一步檢查才能明確病因。

對于無精癥和嚴重少精癥的患者，在行輔助生殖技術治療前，必須進行染色體和Y染色體AZF區微缺失檢測，以便臨床醫師進行預后判斷，從而避免缺陷垂直遺傳。本研究結果提示，臨床醫師應對異性骨髓移植后無精癥患者加以重視，需考慮嵌合狀態的情況，警惕把外周血染色體檢測結果錯判為受者的結果。應運用組織DNA檢測結果來代表移植前的基因狀態，如口腔黏膜細胞、病理切片組織等。有文獻報道[9]，漱口水樣本可用于受者移植前基因型的確定。本研究未嘗試使用漱口水樣本進行檢測。除外周血之外，何種樣本類型適用于Y染色體微缺失檢測，還需增加病例數后再作進一步研究。

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