痰涂片檢出白細胞吞噬細菌在下呼吸道感染診斷中的價值

曹慧玲， 杭 鳴， 趙蘇瑛， 楊 琳， 吳 玲， 李 岷， 汪小蓉

（南京中醫藥大學附屬醫院 江蘇省中醫院檢驗科，南京，210029）

痰標本的涂片染色鏡檢和分離培養是病原學診斷的常用方法，對于診斷呼吸系統感染及指導臨床用藥具有重要價值。下呼吸道標本取樣應用最廣泛、最簡便的方法為自然咳痰法，此法無創、標本易獲得，然而其影響因素較多，尤其易受上呼吸道正常定植菌群的影響，因此經常出現致病菌與定植菌難以區分的情況[1]，在臨床工作中則往往會遇到用藥效果和痰培養藥物敏感性試驗結果不一致的現象[2]。隨著醫療技術的發展，大量抗菌藥物的使用，呼吸道正常定植菌群作為條件致病菌，已成為下呼吸道感染的主要致病菌，也給臨床治療帶來較大的困擾，迫切需要微生物檢驗提供可靠的病原學資料指導臨床診斷及用藥[3]。痰涂片不僅可以用來篩選合格痰標本，其鏡下內容也為下呼吸道感染診斷提供一定的參考依據[4]。本研究用合格痰標本，鏡下觀察標本中白細胞（white blood cell，WBC）吞噬細菌情況，探討其在下呼吸道感染診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本及來源 隨機收集2014年10月—2015年6月南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科微生物室接收的臨床住院患者痰標本175份（上皮細胞≤10或10～25個/低倍視野，WBC≥25個/低倍視野[5]）。

1.1.2 儀器及材料 Vitek 2 Compact全自動細菌分析儀（法國生物梅里埃公司），哥倫比亞血瓊脂平板（安圖生物公司），M-H瓊脂平板（鄭州安圖生物公司），中國藍瓊脂粉（英國Oxoid Limited公司），革蘭染液（珠海BASO公司），顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本處理和鏡檢內容 將痰標本進行涂片，自然干燥，火焰固定后革蘭染色、鏡檢。隨機收集合格痰標本175份，先在低倍鏡下找到合適視野再轉為油鏡仔細觀察至少50個視野，記錄鏡下觀察到的細菌或真菌等微生物以及染色性質（革蘭陽性或革蘭陰性）和形態（桿狀、球狀），同時觀察有無WBC吞噬或伴行細菌現象，若有此現象，則記錄該細菌染色性質和形態等，并計算吞噬WBC所占比例，即50個鏡下視野中找到吞噬細菌WBC的個數/WBC總數。最后將所有標本進行分組，將可見WBC吞噬或伴行細菌的標本為A組，未見WBC吞噬或伴行細菌的標本為B組。

1.2.2 痰標本培養 痰標本以三區劃線法分別接種于血平板、巧克力平板、中國藍平板，置于35 ℃ 5% CO2孵育箱中培養18～24 h（常規培養）。篩選培養分離的可疑菌落用微量生化管或Vitek 2 Compact系統及配套鑒定卡進行鑒定，藥物敏感性試驗采用紙片擴散法或最低抑菌濃度法。當合格痰標本中出現肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、β-溶血性鏈球菌（+）～（++++），或金黃色葡萄球菌、腸桿菌科細菌、不動桿菌、假單胞菌或其他革蘭陰性桿菌（++）～（++++）時，確定為分離的下呼吸道潛在病原菌。

1.2.3 質量控制 質控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）及金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）。

1.2.4 臨床資料收集 查閱電子病歷，包括患者年齡、性別、基礎疾病、是否具有感染癥狀（體溫、咳嗽咳痰等）及其他輔助診斷指標如血常規、胸片等，患者痰標本培養前抗菌藥物使用情況及培養后依據藥物敏感性試驗結果用藥后感染癥狀的改變。

1.2.5 病原菌的確定 患者具有感染指征并且依據藥物敏感性試驗結果指導臨床用藥后治療有效。

1.2.6 定植菌的確定 患者無感染指征或有感染指征但是依據藥物敏感性試驗結果指導臨床用藥后治療無效。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，定性資料用率表示，率之間比較用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床資料

175例患者的年齡為2～95歲，其中70歲以上的老年患者99例，占56.6%，其他臨床資料見表1。

表1 患者的臨床資料

2.2 涂片中WBC吞噬或伴行細菌的確定及比例

WBC吞噬細菌的能力對于抵抗病原微生物的侵入發揮著至關重要的作用。呼吸系統細菌感染時，鏡下可在合格的痰涂片中找到大量的WBC，并且WBC的胞質中包含有大量細菌（吞噬）或WBC周圍分布大量細菌（伴行）（圖1），提示機體免疫系統對入侵的病原微生物發揮吞噬殺菌的功能。51份合格痰標本涂片中發生吞噬的WBC比例平均為30%。

2.3 不同分組的痰涂片標本與細菌培養結果一致性的比較

圖1 痰涂片中WBC吞噬現象

根據鏡下是否檢出WBC吞噬或伴行細菌的情況將痰標本分為A、B 2個組，與最終培養結果進行比較。A組痰涂片中可見WBC吞噬或伴行細菌的有51例，與其相應培養結果一致率達84.3%，B組痰涂片中未見WBC吞噬或伴行細菌的有124例，與培養結果一致率為58.1%，2個組之間比較差異有統計學意義（P＜0.05），A組與B組痰涂片與細菌培養結果的符合性比較見表2。

表2 痰涂片與細菌培養結果符合性 [例（%）]

2.4 不同分組的痰涂片標本與細菌感染率和定植率的關系比較

A組痰涂片標本中檢出致病菌（具有其他感染指征并對抗菌藥物有效）占92.2%，而B組痰標本涂片僅為38.7%，61.3%為檢出呼吸道定植菌群，2個組之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。痰涂片鏡檢結果與細菌感染和定植的關系見表3。

表3 痰涂片與細菌感染和定植的關系 [例（%）]

3 討論

目前，在我國醫院臨床微生物實驗室接收的標本中，痰標本仍然占有很大的比例，然而關于痰培養的標準化操作程序還不盡完善。痰標本留取不合格[6]、在痰培養前或痰培養的同時對痰標本未能進行革蘭染色鏡檢、盛行以優勢菌來判別致病菌、不注重與臨床實際情況相結合等不規范操作，不僅存在誤導臨床診斷的可能，而且也加重了抗菌藥物濫用的現象。由于口咽部有大量正常生理菌群，咳痰標本受口咽部生理菌群的污染不可避免。隨著現代醫療技術的飛速發展，各種抗菌藥物的大量使用，下呼吸道感染病原菌的種類不斷變遷。過去典型的致病菌如白喉棒狀桿菌、百日咳鮑特菌等已顯著減少，相反由條件致病菌引起的感染卻不斷增多，成為下呼吸道感染的主要病原菌。條件致病菌為人體正常菌群的成員，在合適的定居部位不會引起感染，在機體因各種因素造成的抵抗力下降、菌群失調或天然屏障結構破壞時可引起感染發生[7]。因此，條件致病菌引起下呼吸道感染的病原學診斷已成為目前臨床醫學的難點。

本研究在進行痰培養檢查的患者中發現，所有患者均患有不同程度基礎疾病（高血壓、糖尿病等），56.6%的患者年齡在70歲以上，85.1%患者具有一定感染癥狀（呼吸道感染、尿路感染或混合感染），而91.4%的患者在留取痰標本前均不同程度地使用過抗菌藥物，接受了一定的抗菌治療。以上臨床資料表明，呼吸道感染的患者多為年齡較大，有其他基礎疾病，且接受過一定抗菌藥物治療的患者，這些患者免疫力偏弱，易受到致病細菌的侵犯或引起條件致病菌感染。細菌培養是診斷下呼吸道感染疾病的重要手段，但往往存在標本合格率低，培養時間較長，致病菌與定植菌難以區分等不足，痰涂片為培養結果提供了較好的輔助性判斷，根據WBC與上皮細胞的比例可判斷標本是來自下呼吸道，還是非口腔唾液等上呼吸道分泌物[8]。本研究隨機選取175份合格痰標本，比較痰涂片鏡檢結果與培養結果的一致性，統計結果顯示可見WBC吞噬或伴行細菌的痰涂片標本的一致性要顯著高于未見WBC吞噬或伴行細菌的痰涂片標本（P＜0.05），表明在臨床工作中，進行痰涂片觀察時若可見WBC吞噬或伴行細菌，高度提示有培養的必要性。然而仍有小部分存在不一致，其原因可能為：痰涂片中WBC吞噬為機體免疫與微生物共同作用的結果，免疫力較強，細菌基本被清除，培養為陰性，痰涂片上為殘留死菌；痰涂片或培養時采集的痰涂片不一致，有些黏稠的痰液未經消化處理，不能采集到有效部位；工作人員的工作經驗不足等因素。

在病菌與宿主相互作用過程中，宿主吞噬細胞（主要為WBC）大量趨化浸潤至炎癥部位，吞噬殺滅病菌，造成感染癥狀發生[9]。因此，下呼吸道感染患者，不論是由致病菌還是條件致病菌引起，其來自炎癥部位的痰液中必定含有大量WBC。WBC吞噬異物（包括病原菌）是機體的一種非特異性免疫防御機制，即便是健康人群其呼吸道分泌物也會有少量WBC存在，而且不同的個體免疫狀態不同，因此單純的咳痰標本細胞學計數無法確定所培養出的條件致病菌為感染病原菌[10]。本研究將患者具有感染指征并且依據藥物敏感性試驗結果指導臨床用藥后治療有效的確定為致病菌，患者無感染指征或者有感染指征，但是依據藥物敏感性試驗結果指導臨床用藥后治療無效的確定為定植菌。結果顯示A組（痰涂片中可見WBC吞噬或伴行細菌）的標本中（吞噬WBC比例平均為30%）培養出的細菌確定為致病菌的標本有47例（92.2%），而B組（痰涂片中未見WBC吞噬或伴行細菌）的標本培養出的細菌確定為病原菌的標本有48例（38.7%），由此可見痰涂片中可見WBC吞噬或伴行細菌對鑒別致病菌和定植菌有較好的提示作用，為臨床醫生正確認識培養結果、正確判斷下呼吸道感染并合理使用抗菌藥物提供了依據。

綜上所述，痰涂片中檢出WBC吞噬細菌或伴行細菌對下呼吸道感染的病原學診斷具有重要價值，且革蘭染色鏡檢最為經濟、快速，能在早期為患者的診斷和治療提供重要信息[11-12]，此外，結合細菌培養以及藥物敏感性試驗結果可指導臨床用藥，提高臨床診斷的正確性，減輕患者的痛苦和經濟負擔。

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