RBP4對糖尿病腎病無癥狀腦梗死神經(jīng)認知功能的影響

陳丹燕，黃曉龍，盧 松，鄧華聰，甘 華，杜曉剛，王成劍，黃榮曦，張冰寒

(1.重慶市人民醫(yī)院中山院區(qū)內(nèi)分泌腎內(nèi)科,重慶 400013；2.解放軍第三二四醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400028；3.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016；4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400016)

無癥狀腦梗死(silent cerebral infarction，SCI)發(fā)病率逐年增高，SCI一般病灶直徑為2～15 mm，以腔隙性腦梗死型最常見，最主要病理基礎(chǔ)是微小血管病變的基底膜增厚、內(nèi)皮細胞增生和小粥樣斑塊形成，因梗死灶的破壞范圍小或受累的腦組織遠離功能區(qū)而無明顯癥狀和體征，但可以通過CT或MRI等神經(jīng)影像學檢測驗證[1]。若患者反復多次發(fā)作SCI可導致認知功能減退、假性球麻痹、血管性帕金森綜合征、有癥狀性腦梗死等[2]。

視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與糖尿病相關(guān)的脂肪因子，由181個氨基酸殘基組成，屬于RBP家族中分泌型RBP。RBP4由肝臟合成并釋放入血，通過與視黃醇、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白及細胞表面受體相互作用，參與代謝綜合征、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展。RBP4表達水平增高可誘發(fā)糖尿病大血管病變[3-4]，然而，RBP4是否與糖尿病腎病(diabetic nephropathies，DN)患者SCI功能障礙有關(guān)，及其可能發(fā)生機制的研究國內(nèi)外尚少見報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2-10月重慶市人民醫(yī)院60例新診斷DN患者和30例健康志愿者(CON組)為研究對象，根據(jù)影像學結(jié)果將60例DN患者分成并發(fā)SCI組(SCI組)和未并發(fā)SCI組(NSCI組)，每組30例。SCI的診斷符合以下條件[5-6]：(1)無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征；(2)MRI T1加權(quán)像存在低信號，T2加權(quán)像存在高信號，病灶直徑范圍大于3 mm，MRI 彌散加權(quán)成像無高信號?；颊呷虢M標準：(1)患者日常生活和社會活動未受明顯影響；(2)頭顱MRI證實存在SCI病灶；(3)患者均為右利手。排除標準：(1)腦梗死和癡呆病史；(2)其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病史如感染；(3)嚴重軀體疾??；(4)精神心理疾病病史；(5)乙醇或毒品依賴者；(6)病情嚴重或因殘障而無法完成認知功能量表評定者；(7)有活動性出血或出血傾向者；(8)服用非甾體類消炎藥、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素片等藥物者；(9)肝疾病患者。所有研究對象均簽署知情同意書，該研究通過本院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 觀察及檢測指標 臨床資料包括性別、年齡、吸煙史、高脂血癥、心房纖顫史等；檢測指標包括收縮壓、舒張壓、踝臂指數(shù)、頸內(nèi)動脈內(nèi)膜中層厚度(intima-media thickness，IMT)，纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistame，HOMA-IR)、胰島素β細胞功能指數(shù)(homeostasis model assessment for beta cell function，HOMA-β)及體內(nèi)脂肪水平，計算公式如下：

HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5

(1)

HOMA-β=20×空腹胰島素/(空腹血糖-3.5)

(2)

體內(nèi)脂肪水平(男)=1.2×BMI+0.23×年齡-16.2

(3)

體內(nèi)脂肪水平(女)=1.2×BMI+0.23×年齡-15.4

(4)

1.2.2 頸動脈超聲檢查 超聲檢查由兩名嚴格培訓的專業(yè)醫(yī)師操作，所有研究對象均采用多普勒超聲診斷儀，探頭3～9 MHz，掃描雙側(cè)頸動脈，平臥位、前方和側(cè)面做縱向掃描。觀察頸總動脈分叉處和頸內(nèi)、頸外動脈，每個方向縱切測量3個點的IMT，交叉點最厚處為一個點，另外兩個點分別位于交叉部向下1 cm和向下2 cm處，計算平均頸IMT。判斷標準：若IMT<1.0 mm，頸動脈內(nèi)膜光滑者則為正常；若IMT≥1.0～1.2 mm則為頸動脈內(nèi)膜增厚，IMT>1.2 mm則為頸動脈斑塊形成。根據(jù)斑塊形態(tài)臨床意義將低回聲斑塊和潰瘍性混合斑塊歸為不穩(wěn)定性斑塊，強回聲斑與扁平斑歸為穩(wěn)定性斑塊。管腔狹窄30%～50%為輕度，>50%～<70%為中度，≥70%～90%為重度。頸動脈狹窄程度計算公式如下：

頸動脈狹窄程度=1-殘留血管截面積/血管截面積

(5)

1.2.3 評估神經(jīng)認知功能缺損情況 (1)評估神經(jīng)功能缺損程度：由兩名醫(yī)師按國立衛(wèi)生研究院卒中量表(national institutes of health stroke scale,NIHSS)神經(jīng)功能缺損程度評分標準評定，0～1分為正常；>1～4分為輕度；>4～15分為中度；>15～20分為中-重度；>20～42分為重度。(2) 蒙特利爾認知評估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)：從視空間/執(zhí)行功能、注意力與集中、記憶力、語言能力、抽象思維、命名、計算和定向力8個領(lǐng)域進行評估，10 min內(nèi)完成量表，總分30分，≥26分為認知正常；若受教育年限小于或等于12年則加1分。

1.2.4 ELISA檢測外周血血清RBP4水平 禁食10 h后次日晨空腹采集肘靜脈血2 mL，分離血清，-20 ℃保存待檢。ELISA檢測血清RBP4水平，ELISA試劑的批內(nèi)分析和批間分析變異系數(shù)均小于10%，所有樣本設(shè)3個復孔。

1.2.5 Western blot檢測脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)和趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)表達 提取總蛋白用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。每孔上樣50 μg，加等體積2×加樣緩沖液，100 ℃變性5 min，60 V電泳至樣品進入分離膠，120 V電泳2 h，取出凝膠。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，3%脫脂奶粉稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，0.05%Tris緩沖鹽-Tween溶液室溫漂洗后與3%脫脂奶粉稀釋后的二抗37 ℃搖動孵育2 h，充分洗滌后5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑硝基藍染色試劑盒顯示蛋白印跡條帶。Quantity One圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組對象臨床檢測指標比較 SCI和NSCI組患者的年齡、性別、病程時間、危險因素(吸煙史、高脂血癥、心房纖顫史、收縮壓和舒張壓)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CON組HOMA-IR、HOMA-β和HbA1c明顯低于DN患者(P<0.05)；在DN患者中SCI組HOMA-IR、HOMA-β和HbA1c與NSCI組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NSCI組患者IMT、FIB和體內(nèi)脂肪水平均低于SCI組，而高于CON組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NSCI組患者踝背指數(shù)高于SCI組，而低于CON組，組間比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組對象臨床檢測指標比較(n=30)

a：P<0.05，與CON 組比較;b：P<0.05，與NSCI組比較

2.2 SCI患者MRI圖像特征和臨床表現(xiàn) SCI患者梗死灶大小不一，多呈圓形、類圓形，其中腔隙性腦梗死18例；單發(fā)病灶者10例，2個及以上病灶者20例。梗死灶位于基底節(jié)區(qū)10例、內(nèi)囊7例、腦室2例、放射冠3例、顳葉3例、丘腦6例、橋腦3例和小腦2例。SCI患者非特異性癥狀包括頭痛8例、頭暈10例、乏力9例、主觀感覺肢體麻木12例、反應遲鈍10例、健忘15例。

2.3 頸動脈粥樣硬化程度比較 30例SCI患者中，20例有頸動脈粥樣硬化斑塊形成，頸動脈粥樣硬化斑塊檢出率明顯高于NSCI組，其中SCI組不穩(wěn)定斑塊例數(shù)和狹窄程度均明顯高于NSCI組(P<0.05)，見表2，圖1。

表2 SCI組與NSCI組頸動脈粥樣硬化斑塊及狹窄程度比較[n(%),n=30]

a：P<0.05，與SCI 組比較

A:正常頸動脈內(nèi)膜；B：頸動脈內(nèi)膜增厚；C：頸動脈軟斑；D：頸動脈混合斑；E：頸動脈硬斑

圖1 頸動脈內(nèi)膜厚度和斑塊超聲檢圖像

2.4 SCI組與NSCI組患者神經(jīng)功能缺損程度評分和MoCA評分比較 與NSCI組患者相比，SCI組NIHSS評分增高(4.43±1.12vs. 8.48±3.69，P<0.05);而視空間/執(zhí)行能力、注意力與集中、計算、抽象思維、記憶力、定向力和MoCA綜合評分均降低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SCI組命名和語言能力評分雖較NSCI組低，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 SCI組與NSCI組患者MoCA評分比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與NSCI組比較

2.5 血清RBP4水平及其與神經(jīng)認知功能損害相關(guān)性 與NSCI組比較，SCI組血清RBP4水平明顯增高(17.02±1.83vs. 28.59±2.16，P<0.05)。SCI組血清RBP4水平與神經(jīng)功能缺損NIHSS評分和MoCA綜合評分均呈正相關(guān)(r=0.72、0.80，P<0.05)。

2.6 Logistic回歸分析 以DN患者是否并發(fā)SCI為因變量，將IMT、踝背指數(shù)、體內(nèi)脂肪水平和RBP4作為自變量引入單因素Logistic回歸分析，按α=0.05標準，最終ITM、踝背指數(shù)和RBP4納入回歸模型。進一步多元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)ITM和RBP4與DN患者并發(fā)SCI存在回歸關(guān)系，見表4。

2.7 Lp-PLA2和CXCR4表達 與CON組比較，SCI組和NSCI組患者Lp-PLA2和CXCR4表達水平均明顯增高，其中SCI組Lp-PLA2和CXCR4表達水平明顯高于NSCI組，組間比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表4 DN并發(fā)SCI的影響因素Logistic回歸分析

表5 各組研究對象Lp-PLA2和CXCR4表達 水平比較

a：P<0.05，與CON 組比較;b：P<0.05，與NSCI組比較

3 討 論

DN患者微血管基底膜增厚，腎小球內(nèi)血流動力學異常，激發(fā)慢性炎癥反應，促進血小板聚集并釋放活性物質(zhì)，形成微血栓，神經(jīng)細胞凋亡增多，缺血性壞死組織形成腔隙狀態(tài)，臨床上表現(xiàn)為SCI和反復發(fā)作的短暫性腦缺血發(fā)作。本研究結(jié)果提示，DN并發(fā)SCI患者神經(jīng)功能缺損程度較NSCI患者重，結(jié)合MoCA量表評估結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI患者的視空間/執(zhí)行能力、注意力與集中、計算、抽象思維、記憶力、定向力和綜合評分均明顯低于NSCI組，而命名、語言能力評分雖較NSCI組低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明早期SCI患者較少出現(xiàn)語言功能障礙。

動脈粥樣硬化是缺血性腦血管疾病的重要病理、生理基礎(chǔ)。頸動脈硬化及狹窄程度越重，狹窄處血流越快，越易導致斑塊破裂形成新血栓。本文頸動脈超聲結(jié)果表明所有DN患者均存在不同程度IMT變化。SCI組頸動脈斑塊檢出率達63.33%，而NSCI 組檢出率為30.00%，其中SCI組頸動脈狹窄程度高于NSCI組，提示頸動脈狹窄粥樣硬化斑塊形成與DN患者并發(fā)SCI密切相關(guān)。XIAO等[7]發(fā)現(xiàn)，血清RBP4水平與IMT呈正相關(guān)。校正心血管疾病危險因素后，ROH/RBP4比值與IMT高度相關(guān)，提示游離RBP4可能在動脈粥樣硬化發(fā)生中起特殊作用[8-9]。RBP4可自由經(jīng)腎小球濾過，幾乎全部被近曲小管重吸收，其是提示DN早期腎損害的重要因子，亦是隨訪DN病情的重要指標[10-11]，尿中RBP4水平與糖尿病患者血糖控制情況和HbA1c水平有關(guān)[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI組患者血清RBP4水平明顯高于NSCI組，提示血清RBP4可作為DN并發(fā)SCI的預測因子，且SCI患者血清RBP4水平與神經(jīng)功能缺損NIHSS評分和MoCA綜合評分均呈正相關(guān)。

機體在持續(xù)性炎癥刺激下，Lp-PLA2促進炎癥因子級聯(lián)反應，使胰島素受體信號負反饋環(huán)路受阻，加速DN的發(fā)生、發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)，Lp-PLA2在受損或破裂粥樣斑塊的壞死中心或周圍的巨噬細胞中表達明顯增高[13-14]。機體內(nèi)80%Lp-PLA2與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)結(jié)合，通過水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)中氧化修飾的磷脂產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿和氧化型游離脂肪酸，后二者具有強致炎性，可通過誘導內(nèi)皮細胞生成細胞黏附分子和細胞因子，促進單核細胞聚集并移行入血管內(nèi)膜，并進一步分化為巨噬泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化形成[15]，是缺血性腦血管疾病發(fā)病的獨立危險因子。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SCI患者Lp-PLA2和CXCR4表達水平高于NSCI組。推測Lp-PLA2引起DN患者并發(fā)SCI的可能機制是：(1)DN患者氧化應激系統(tǒng)被激活，內(nèi)皮細胞損傷和炎性介質(zhì)釋放增多，Lp-PLA2生成增多活性增強，誘發(fā)和(或)加劇炎癥反應，促進動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊釋放CXCR4增多，斑塊易破裂，導致血栓形成和腦血管事件發(fā)生；(2)Lp-PLA2生成增多，循環(huán)系統(tǒng)中血液黏稠度增高，促進粥樣斑塊形成和穩(wěn)定性減弱，誘發(fā)心腦血管疾病；(3)溶血卵磷脂破壞血管內(nèi)皮完整性，導致平滑肌細胞過度增殖并向內(nèi)膜遷移，促進粥樣硬化斑塊形成。

綜上所述，SCI患者的病情評估和管理很大程度上影響患者預后，DN并發(fā)SCI患者尤其是伴有吸煙、高血壓、血脂紊亂、頸動脈狹窄的糖尿病患者，無論是否伴有SCI均應定期隨訪，以減輕家庭和社會負擔。本研究發(fā)現(xiàn)，RBP4水平與SCI患者神經(jīng)認知功能損害程度呈正相關(guān)，其可作為該病的預測因子，Lp-PLA2/CXCR4通路活化可能是發(fā)病機制之一，但該研究尚存在樣本量小，未比較RBP4對不同DN分期SCI患者神經(jīng)認知功能缺損的影響等不足，后續(xù)研究將就以上不足繼續(xù)深入探討，為臨床防治DN并發(fā)SCI提供更科學的理論數(shù)據(jù)。

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