2型糖尿病患者脂肪間充質干細胞成脂肪分化能力的實驗研究

李素燕，陳倩雅，邱友燕，蔣 嬋

(廣東省廣州市增城區人民醫院：1.內分泌科；2.腫瘤內科 511300)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是指由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)以胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙為特征。肥胖是T2DM的獨立危險因素，有研究表明，中國T2DM患者的肥胖發病率明顯升高[1]，且T2DM患者肥胖發病率與總體人群相比明顯提高[2]。然而，目前T2DM患者肥胖發病率升高的病因尚未明確。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是指來源于中胚層的具有多向分化潛能的一類多能干細胞，是干細胞家族的重要成員之一。脂肪MSDs(adipose-derived MSCs，ADSCs)是指存在于脂肪組織的多能干細胞，具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等分化的多向分化能力，在臨床和組織工程學中得到了廣泛的研究[3-4]。然而，作為人體脂肪組織的主要來源細胞，ADSCs在T2DM患者中的成脂肪分化能力尚少有相關報道。本研究探討T2DM患者來源的ADSCs成脂肪分化能力，可為T2DM患者肥胖發病率的升高提供理論依據和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶細胞消化液、DMEM培養基、青霉素鏈霉素溶液(Gibco公司，美國)；抗人CD105、CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、人類白細胞抗原DR(HLA-DR)抗體(Becton Dickinson公司，美國)；PBS(上海博谷生物科技有限公司)；油紅O、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、重組人胰島素、地塞米松、吲哚美辛(Sigma公司，美國)；Ⅰ型膠原酶(MP Biomedicals公司，美國)；Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8，日本)；異丙醇、75%乙醇(廣州化學試劑廠)；Trizol 裂解液、熒光定量PCR管(Invitrogen公司，美國)；qPCR 引物(上海英濰捷基貿易有限公司)；SYBR Premix Ex Taq、逆轉錄試劑盒(Takara公司，日本)；培養瓶、離心管、6孔培養板、移液器槍頭、EP 管、PCR 管(上海樊克公司)；移液槍(Brand公司，德國)；CO2細胞培養箱、離心機、酶標儀、PCR儀(Thermo Fisher公司，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離和培養 脂肪組織標本取自廣州市增城區人民醫院普外科9例非糖尿病患者(視為健康者作為對照組)和9例T2DM患者(T2DM組)腹部手術腹部皮下脂肪組織，患者年齡40～60歲，無感染，未患惡性腫瘤、其他內分泌及全身代謝性疾病。本研究已獲得醫院醫學倫理委員會批準，患者已簽署知情同意書。無菌條件下取出脂肪組織20 mL后，用PBS沖洗3次，去除表面結締組織及血管，用眼科剪將其剪碎。加入等體積含10%FBS，0.1%Ⅰ型膠原酶DMEM培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中消化12 h。消化結束后100目篩網過濾，250 g離心5 min，除去上清液，用完全培養基(含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)重懸細胞，接種于25 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每3 天換液1次，當細胞達到90%融合以上進行傳代，取第3代細胞進行后續實驗。

1.2.2 觀察細胞形態及生長曲線 光鏡下觀察兩組細胞從原代至第3代生長形態。用0.25%胰酶將第3代ADSCs消化離心后以5×103個/孔密度接種于96孔培養板中，24 h貼壁后于第1～10天加入10 μL CCK-8溶液，4 h后測量其在450 nm的吸光度(OD)值。以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.3 檢測細胞表型 用胰酶將生長良好的兩組細胞消化后，250 g離心5 min，除去上清液，用PBS重懸成100 μL濃度為1×109/L的細胞懸液并裝入流式管中。每管分別加入3 μL抗人CD105、CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、HLA-DR抗體，常溫下避光孵育30 min后，用PBS沖洗，250 g離心5 min后用200 μL的PBS重懸，流式細胞儀檢測細胞相應表型的表達情況。

1.2.4 觀察細胞成脂分化情況 將生長良好的兩組細胞消化離心并以1×105個/孔細胞數量接種于6孔板中，24 h貼壁后加入成脂肪誘導DMEM培養基(含0.5 mmol/L IBMX、10 μg/mL重組人胰島素、1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，每3 天進行半量換液。第7 天開始細胞在光鏡下可見有脂肪液泡形成，第14 天鏡下可見明顯脂肪液泡形成，棄去培養基，用0.4%多聚甲醛對細胞進行固定后，用油紅O染色并在光鏡下觀察細胞染色情況。PBS洗滌3次后加入異丙醇，充分震蕩至染色脂滴全部脫落，轉移至96孔板后在490 nm波長下測定其OD值，異丙醇標定。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測 對兩組細胞進行成脂肪誘導14 d后，用Trizol裂解液裂解細胞并提取總RNA，測定RNA純度及濃度，取OD260/OD280為1.8～2.0的RNA行進一步實驗。參考逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA。采用20 μL反應體系，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL、去離子水8.5 μL、cDNA 0.5 μL及上下游引物(引物上下游序列見表1)各0.5 μL。PCR擴增條件：起始95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。擴增完畢得到的Ct值通過擴增動力學曲線方程計算2-△△Ct，得到相對表達量。

表1 qPCR引物上下游序列(5′-3′)

2 結 果

2.1 兩組ADSCs細胞形態及生長曲線比較 原代細胞培養24 h后開始貼壁，最初貼壁細胞呈橢圓形，后貼壁細胞逐漸增多，細胞從橢圓形逐漸變成梭形。隨著細胞分裂增殖，約10 d后原代細胞可長滿25 cm2培養瓶。傳代后細胞增殖速度加快，兩組第3代ADSCs為均一的成纖維細胞樣形態，光鏡下未見明顯區別(圖1)。第3代ADSCs生長曲線均呈S形，生長潛伏期為1～2 d，對數增殖期為3～6 d，第7 天開始生長速度減慢，進入增殖平臺期。兩組ADSCs 1～10 dOD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

A：對照組；B：T2DM組

圖1 第3代ADSCs光鏡下形態(×40)

圖2 兩組第3代ADSCs生長曲線比較表2 兩組ADSCs表型表達率比較

組別CD105CD90CD45CD29CD14CD34CD44HLA-DR對照組96.71±1.3897.33±0.8196.74±2.5595.83±2.150.16±0.110.28±0.220.19±0.210.41±0.27T2DM組97.18±2.1298.15±1.4597.11±2.6596.01±2.390.23±0.120.34±0.370.24±0.320.38±0.32

表3 兩組ADSCs PPAR-γ、C/EBP-α、C/EBP-β mRNA表達水平比較

a：P<0.05，與對照組比較

2.2 兩組ADSCs表型鑒定 兩組細胞均陽性表達CD105、CD90、CD45、CD29，陰性表達CD14、CD34、CD44、HLA-DR，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 兩組ADSCs成脂肪分化比較 成脂肪分化誘導第7 天開始在光鏡下可見ADSCs有脂肪液泡形成，第14 天鏡下脂肪液泡形成明顯增多，油紅O染色后可見脂肪液泡被染成紅色，且T2DM組脂肪液泡數量明顯多于對照組(圖3)。用油紅O染色提取法對兩組ADSCs成脂肪分化進行定量分析，發現14 d時對照組OD值為0.721±0.112，T2DM組OD值為1.135±0.158，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

A：對照組；B：T2DM組

圖3 兩組ADSCs光鏡下表現(×100)

2.4 兩組對象ADSCs PPAR-γ、C/EBP-α、C/EBP-β mRNA表達水平比較 成脂肪誘導前兩組PPAR-γ、C/EBP-α、C/EBP-β mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，成脂肪誘導14 d后T2DM組PPAR-γ、C/EBP-α、C/EBP-β mRNA表達水平明顯升高，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

3 討 論

隨著我國經濟的發展和人們生活方式的轉變，近年來我國DM發病率明顯升高。2010年中國國家疾病控制中心和中華醫學會內分泌學分會調查了我國DM的患病情況發現，18歲以上人群DM患病率為11.6%，我國可能已成為世界上DM患病人數最多的國家[5]，DM及其并發癥給患者及社會帶來了沉重的健康和經濟負擔。其中，T2DM患者占DM患者的60%以上，主要由胰島素抵抗和胰島素分泌不足引起[6]。T2DM患者肥胖發病率明顯增高，且隨著體質量的增加，T2DM并發癥發生風險也會增加[7]。但是，T2DM患者肥胖發病率升高的病因尚未明確。

MSCs具有多向分化及免疫抑制等特性，MSCs的異?？赡芘cDM的發生、發展相關。多項實驗和臨床研究發現，MSCs可提高患者胰島素及C肽水平[8]，有效降低糖化血紅蛋白水平[9]，甚至可有效促進T2DM患者慢性潰瘍的愈合[10]。上述研究不僅提示MSCs有望成為T2DM的治療手段之一，也從另一方面說明了T2DM患者體內MSCs水平存在異常，可能參與到T2DM患者的疾病發生、發展中。有研究發現T2DM患者ADSCs免疫抑制能力下降，可能與T2DM患者體內炎癥水平的上升有關[11]。同時，ADSCs作為MSCs家族成員之一，與人體脂肪形成密切相關。那么ADSCs是否參與到T2DM疾病發展過程中從而促進T2DM患者肥胖的發生呢？于是作者提取并分離T2DM患者和健康者ADSCs，并對其生物學特性和成脂肪分化能力進行探討。

拾莉等[12]采用酶膠原消化法從T2DM患者的脂肪組織中分離出ADSCs，并成功對其免疫表型進行了鑒定，成功將其誘導成脂肪細胞；但該研究并未將T2DM患者ADSCs與健康者ADSCs進行比較。本研究對T2DM患者與健康者ADSCs進行比較，發現T2DM患者與健康者ADSCs在細胞形態及生長速度方面無明顯差異(P>0.05)，均陽性表達MSCs表型CD105、CD90、CD45、CD29，陰性表達造血干細胞表型CD14、CD34、CD44、HLA-DR，說明兩組細胞均符合MSCs的鑒定標準[13]。從第7天開始兩組ADSCs開始向脂肪細胞分化，通過油紅O染色提取法發現第14天T2DM患者ADSCsOD值明顯高于對照組(P<0.05)，說明第14天T2DM患者ADSCs成脂肪分化能力明顯高于健康者。PPAR-γ、C/EBP-α、C/EBP-β是脂肪細胞的重要標志基因[14]，成脂肪誘導14 d后T2DM患者ADSCs上述基因表達水平明顯高于健康者，進一步說明了T2DM患者ADSCs成脂肪分化能力明顯高于健康者ADSCs。

T2DM的發病部分是由于機體低水平慢性炎癥反應導致[15]。相關流行病學研究已經報道炎性因子如C反應蛋白，腫瘤壞死因子-α，白細胞介素-6，白細胞介素-1β等表達水平在T2DM患者中明顯提高[16-19]，而且這些炎性因子的水平越高，患者胰島素抵抗程度越高，從而導致機體對胰島素敏感性越低，最終發展成糖代謝異常[20-21]。相關研究已表明炎性因子可明顯提高ADSCs的成脂肪分化能力[22]。所以，本研究認為T2DM患者體內的低水平慢性炎癥可能會通過提高機體內ADSCs的成脂肪分化能力，從而促進更多的ADSCs向脂肪細胞分化，最終加快肥胖的發生、發展。

綜上所述，本研究成功從健康者和T2DM患者脂肪組織中提純、培養及鑒定了ADSCs，并進一步證明了T2DM患者ADSCs成脂肪分化能力明顯高于健康者ADSCs。下一步將通過體內實驗及進一步的分子生物學研究來探討T2DM患者ADSCs成脂肪分化能力明顯高于健康者ADSCs的相關分子機制。

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