環磷酰胺及其代謝產物作用于卵巢癌細胞SKOV3后對PTEN基因的影響

熊正方，李 冰，曾湘暉，王莉云

(青海省人民醫院生殖中心，西寧 810007)

卵巢癌是女性生殖器惡性腫瘤之一，具有高度致死性。目前抗擊卵巢癌的主要方法包括改進治療和早期診斷。雖然已知早期疾病的檢測可以延長存活率，甚至治愈，但是目前卵巢癌都是在晚期被發現，手術和化療的治愈率有限[1-2]。因此，對治療方案的選擇及化療存在的毒性進行深入研究顯得極為重要。環磷酰胺(CP)是一種烷化劑，可導致皮質纖維化，血管損傷和原始卵泡嚴重減少，同時也可以阻止細胞增殖和凋亡[3]。盡管CP有很多益處，但CP也可引起諸多不良反應。CP可能導致正常組織損傷，如腎臟過氧化損傷，急性心臟毒性作用和骨髓抑制[4]。CP可通過產生DNA交聯和促進DNA斷裂來誘導細胞毒性，故大多數卵巢癌幸存者有卵巢毒性和不育[5-6]。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN) 位于10號染色體，是具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶雙特異性活性的一種抑癌基因，其主要通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路去磷酸化來抑制腫瘤生長。PTEN基因的抑癌作用依賴于其磷酸酶活性并且磷酸酶催化結構域的功能喪失通常與致癌性PTEN突變有關[7]。本文將應用蛋白質研究的相關技術從新的角度研究CP作用蛋白后對PTEN磷酸化活性及其通路蛋白磷酸化活性的影響，從而探討PTEN基因與藥物代謝作用產生細胞毒性的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要材料：PTEN蛋白購自上海吉凱公司；SKOV3細胞株由美國ATCC公司提供；CP(相對分子質量為279.01)和丙烯醛(acrolein,ACR)購自美國Sigma公司。主要試劑：PTEN抗體、P53抗體、TP53抗體購自美國Abcom公司；二抗山羊抗鼠、二抗山羊抗兔購自北京碧云天生物公司；硝基苯磷酸二鈉(PNPP)、生物素試劑購自美國Sigma公司；生物素特異抗體購自Santa Cruz公司；ACR抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 PNPP法檢測磷酸酶活性 反應液組成：50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8，不同濃度ACR(40、20、10、5 μmol/L)，CP 100 μmol/L，室溫作用30 min，加入0.1 mg/mL PNPP試劑，酶標儀450 nm下讀取光密度(OD)值。96孔板總體系100 μL。

1.2.2 Western blot檢測 重組PTEN(rPTEN)蛋白中加入不同濃度藥物作用，蛋白濃度1 mg，藥物濃度為10、50 μmmol/L ACR，室溫作用30 min，加入蛋白緩沖上樣液進行凝膠電泳，尼龍膜轉膜1 h，ACR抗體1∶1 000比例稀釋，于4 ℃孵育過夜，PBS洗滌膜，二抗稀釋比例1∶10 000，室溫孵育1 h，洗干凈膜，增強化學發光劑電化學發光法(ECL)顯影。

1.2.3 生物素酰肼1(biotin-hydrazide,BH2)與蛋白作用 實驗分組：(1)牛血清清蛋白(BSA)0.50 mg/mL組(A組)；(2)BSA 0.50 mg/mL+ACR 50 μmmol/L組(B組)；(3)BSA+BH組(C組)；(4)BSA+ACR 50 μmmol/L+BH組(D組)；(5)rPTEN 0.50 mg/mL組(E組)；(6)rPTEN 0.50 mg/mL+ACR 50 μmmol/L組(F組)；(7)rPTEN 0.50 ng/mL+BH組(G組)；(8)rPTEN 0.50 mg/mL+ACR 50 μmmol/L+BH組(H組)；(9)rPTEN 0.50 mg/mL+ACR 10 μmmol/L+BH組(I組)。藥物室溫作用30 min后，加入1 μmol/L生物素，電泳轉膜，蛋白封閉，加入生物素抗體稀釋比例1∶1 000，PBS洗膜15 min，ECL直接顯影。

1.2.4 細胞培養 90%DMEM高糖培養基，10%胎牛血清，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養2 d，1 mL胰酶(0.25%Trypsin-0.53 mmol/L EDTA)消化傳代。取對數成長期細胞，進行實驗。

1.2.5 細胞提取蛋白 應用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)技術提取PTEN蛋白。細胞裂解液[含PBS、1%Triton、苯甲基磺酰氟(PMSF)]加入細胞，冰上裂解20 min，4 ℃，13 000 g離心20 min，吸取上清液。蛋白濃度500 μg，在總體積1 000 μL下加入等量PTEN及NAT-1抗體及細胞裂解液，4 ℃搖床過夜，次日加入Protein agrose于4 ℃下孵育2 h，細胞裂解液洗滌3次，PBS洗滌1次，棄上清液，得到目的蛋白。

1.2.6 細胞內蛋白酶活性檢測 將0.5 mmol/L EE5、1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、TrisbufferPH8(30 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl，pH 8)加入IP技術提取的蛋白沉淀中，室溫孵育30 min，加入0.5%HCLO41∶1比例，HPLC儀器檢測。

1.2.7 高校液相色譜(HPLC)技術 反應液buffer配制:100 mmol/L sodium acetate pH 7，1 mmol/L DTT，50 μmol/L EE5反應液加入IP所得蛋白中，37 ℃作用30 min，96孔板中每孔終體積100 μL，加入100 μL 15% HCLO4終止反應，上機檢測。

2 結 果

2.1 rPTEN蛋白磷酸酶活性檢測 CP作用于蛋白后不影響活性改變；40、20、10、5 μmol/L的ACR作用PTEN蛋白后，rPTEN蛋白隨著藥物濃度增加磷酸酶活性降低，見圖1。

2.2 ACR特異抗體與蛋白結合 ACR抗體與蛋白結合，隨藥物濃度增加表達越明顯，不加藥物的蛋白與抗體不結合，見圖2。

2.3 BH作用蛋白表達 高濃度藥物組與生物素的結合表達更加明顯，不加藥物組則無表達，見圖3。

2.4 HPLC對細胞內藥物作用的結果 隨著不同的藥物濃度作用細胞蛋白后，蛋白酶活性降低，此結果與rPTEN蛋白的活性結果一致，見圖4。

1:ACR 40 μmol/L+PTEN;2:ACR 20 μmol/L+PTEN;3:ACR 10 μmol/L+PTEN;4:ACR 5 μmol/L+PTEN;5:CP 100 μmol/L+PTEN;6:1% DMSO+PTEN;7:rPTEN；a：P<0.05,與rPTEN比較

圖1 PNPP檢測rPTEN蛋白活性

1：rPTEN；2：10 μmol/L ACR+PTEN；3：50 μmol/L ACR+PTEN；a：P<0.05，與rPTEN比較

圖2 Western blot 檢測蛋白表達

1：E組；2：I組；3：D組；4：H組；5：G組；a：P<0.05，與G組比較

圖3 Western blot 檢測BH作用蛋白表達

1:ACR 40 μmol/L+PTEN;2:ACR 20 μmol/L+PTEN;3:ACR 10 μmol/L+PTEN;4:ACR 5 μmol/L+PTEN;5:CP 100 μmol/L+PTEN;6:1% DMSO+PTEN;7:rPTEN；a：P<0.05,與rPTEN比較

圖4 HPLC檢測蛋白活性

2.5 TP53對藥物作用的蛋白表達 Western blot結果顯示TP53的表達隨著藥物濃度增高而減少，P53表達沒有變化，見圖5。

1：rPTEN；2：10 μmol/L ACR+rPTEN；3：50 μmol/L ACR+PTEN；a：P<0.05，與rPTEN比較

圖5 Western blot 檢測P53/TP53蛋白表達

3 討 論

卵巢癌是女性發病率第二的婦科癌癥，僅次于子宮內膜癌的發生。雖然卵巢癌的病因尚未完全了解，但可能與年齡，晚育有關，早期發病在月經初期或晚期絕經，同時乳腺癌突變也涉及卵巢癌的形成和發展[8-9]。

化療仍然是當今卵巢癌治療中常用的方法，化療方案選擇通常有順鉑或卡鉑與CP組合[10]。但是化療藥物尤其是CP存在細胞毒性，對治療卵巢癌療效并不十分明顯[8]，組合化療中的劑量選擇未有明確有效的單位,其產生的細胞毒性及對抑癌基因的影響機制是本研究的重點。

本研究通過磷酸酶活性檢測得出ACR直接抑制抑癌基因PTEN的磷酸酶活性，考慮其磷酸化活性的降低可能是導致細胞毒性的主要方式。因此可推測ACR使蛋白活性降低，從而抑癌基因作用減弱或發生突變。

CP的代謝產物ACR為不飽和醛類，其含有雙鍵和醛基兩種官能團，其共價鍵在特定催化條件下可發生加成反應[11]。本研究中ACR特異抗體與蛋白結合表達增高，說明ACR可通過共價鍵與蛋白直接作用形成ACR-PTEN加合產物，這種加合產物的形成是邁克爾加成作用的結果。本研究可推測出細胞毒性的產生由共價結合導致使其磷酸酶活性降低。

BH是測定蛋白質羰基化探針性生物素衍生物。在親和細胞化學中，酰肼功能化基團通過低聚糖部分容許糖脂及糖蛋白的生物素酰化[12]。本研究結果圖3顯示BH檢測出PTEN蛋白與ACR上游離醛羰基作用形成共價鍵，這種共價鍵加合產物的形成可能與導致細胞磷酸酶活性降低，以及蛋白結構改變有關。

HPLC結果顯示細胞內蛋白活性隨著藥物濃度增高而降低，這與ACR與重組蛋白作用結果表達一致，說明無論在蛋白層面即體外還是細胞內ACR對PTEN的影響不變，并且此影響較穩定，不會隨著內環境改變，這對后續研究提供了有效依據。

PTEN基因參與PI3K/Ak通路，其作用主要調節其下游蛋白的磷酸化，以及調節細胞凋亡增殖等[13]。本研究主要選擇P53及TP53作為主要研究通路，研究結果顯示P53蛋白表達在藥物作用后不變，TP53表達隨藥物濃度改變，表示其突變主要可能發生在TP53。關于TP53是點突變還是失活突變還需要做進一步研究。

本研究結果得出ACR直接可以修飾PTEN蛋白結構和影響其活性改變，ACR對蛋白的這種類似反應也發生于NAT-1蛋白上[14]，但是與PTEN蛋白作用的具體細節及對其他通路磷酸化活性的影響還需做進一步研究。ACR的這種特征對疾病的病因判斷，選擇治療方案和治療劑量開辟了新的思路及研究方法。

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