透明質酸修飾的綠原酸脂質體的制備及細胞學研究

趙玉璽，張 帆，楊 琴，魏 瑩，陳 釧，劉 福

(川北醫學院藥學院藥物研究所，四川南充 637000)

綠原酸(chlorogenic acid，CA)是金銀花、杜仲等藥材中的重要活性成分，也是具有重要應用開發前景的多酚類活性物質[1]。研究表明CA具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒、降血壓等作用[2]。近年來，研究發現CA還具有抗腫瘤的作用[3]。但是CA是脂溶性藥物，難溶于水，在腸道中吸收差，所以使其應用受到很大的阻礙[4]。脂質體是具有良好的生物相容性的納米載體[5]，脂質體包封脂溶性藥物可以有效地提高其在體內的生物利用度，增強療效，同時脂質體表面修飾配體是構建主動靶向脂質體的重要方式，能夠使其靶向到特異性組織[6]。透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種天然多糖，是目前研究較多的一種主動靶向配體，已被證實可誘導引發受體介導的細胞內信號[7]。人體內有多種HA 受體，如CD44受體、HA介導能動性受體(RHAMM)、HA內吞受體(HARE)等，其中CD44研究最為廣泛深入。有研究表明，CD44與多種腫瘤的生長、發展、轉移和預后密切相關，包括腺癌、卵巢癌、乳腺癌等[8]，CD44受體可同HA特異性結合，通過受體-配體機制實現靶向藥物遞送的目的[9]。因此表面經HA及其衍生物修飾的脂質體可靶向遞送抗腫瘤藥至HA受體高表達的腫瘤細胞和組織。本研究選取HA為主動靶向的配體修飾載CA的脂質體(HA-CA脂質體)，用以增加CA的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Sartorius BP211D電子天平(德國 Sartorius公司)；ALPHA 2-4 LSC凍干機(德國Christ公司)；CJ-2S超凈臺(江蘇天潤儀器有限公司)；DM-IL倒置顯微鏡(德國徠卡公司)；TGL-16G-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；Forma Series細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司)；恒溫搖床(北京同正生物技術發展有限公司)；Model 550酶聯分析儀(美國BIORAD公司 )；100、1 000 μL移液槍 (美國Thermo Scientific公司)；Thermo Array scan VTI 高內涵篩選儀(Thermo Scientific)。

1.1.2 藥品與試劑 CA(BR，99.99%)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，≥99.00%)、大豆卵磷脂(≥99.00%)、膽固醇(≥99.00%)、Hochest 33258(≥98.00%)、噻唑藍(MTT，98.00%，美國Sigma公司)；HA鈉(Mw=8 000 Da，山東福瑞達生物化工有限公司)；胎牛血清(FBS，美國GIBCO 公司)；胰酶、DMEM培養基(美國Hyclone公司)；6-香豆素(日本TCI公司8LUEF-CC)；其余試劑為分析純。

1.1.3 細胞 人肺腺癌A549細胞(川北醫學院藥物研究所)；人肝癌HepG2細胞(川北醫學院藥物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 HA-DOPE的制備[10]稱取HA 30 mg，置10 mL蒸餾水中溶脹后超聲溶解。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)60 mg和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHSS)90 mg，加氫氧化鈉溶液調至pH 7.5，于37 ℃水浴活化24 h。持續攪拌下滴加含DOPE 72 mg的混懸液，反應過夜。透析除去反應液中多余反應物和副產物，經薄層色譜(展開劑：氯仿∶甲醇∶水為65∶25∶4，碘蒸氣顯色)驗證反應液中已無游離DOPE存在，冷凍干燥即得。

1.2.2 HA-CA脂質體的制備 精密稱取卵磷脂120 mg，膽固醇30 mg(磷脂比為4∶1)，CA 5 mg于茄型瓶中，加入氯仿丙酮混合溶劑10 mL(氯仿:丙酮體積比為4∶1)，超聲使其充分溶解，置于旋轉蒸發儀中將溶劑蒸出，直至在瓶壁上形成均勻的脂質膜。加入3 mL(pH 7.4)PBS磷酸鹽緩沖溶液和2 mL HA-DOPE的PBS溶液(HA-DOPE為1 g/L)后在60 ℃水浴條件下水化1 h，即得。

1.2.3 CA體外水平測定方法的建立 (1)色譜條件[11]：Thermo C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇∶0.1%冰醋酸(30∶70)；檢測波長為330 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為30 ℃。(2)標準曲線的繪制：精密稱取CA原料藥適量，用甲醇溶解，制備成質量濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 g/L的梯度標準溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。在以上色譜條件下測定CA的峰面積。

1.2.4 精密度實驗 精密吸取濃度為0.20 g/L的CA樣品溶液進樣，按照1.2.3色譜條件測定，共測6次，計算相對標準偏差(RSD)。

1.2.5 穩定性實驗 精密吸取濃度為0.20 g/L的CA樣品溶液進樣測其穩定性，3 h測1次，共測6次，計算RSD。

1.2.6 回收率實驗 精密量取濃度為0.40 g/L的CA樣品溶液適量，按比例加入HA空白脂質體1 mL，用流動相配成高、中、低3種質量濃度的CA脂質體溶液，每種5份，加甲醇破壞脂質體，稀釋定容至刻度，搖勻，離心吸取上清液，按照1.2.3色譜條件測定。

1.2.7 HA-CA脂質體的包封率測定 采取離心法測定脂質體的包封率。取HA-CA脂質體溶液2 mL，置于離心管中，以14 000 r/min離心30 min，下層沉淀部分即制備的姜黃素脂質體。小心倒去含有游離姜黃素的上層溶液，用甲醇溶液超聲20 min溶解底部的姜黃素脂質體后置5 mL容量瓶中定容后，按照1.2.3的色譜條件測定CA的峰面積，代入標準曲線，按外標法計算CA的水平，并計算HA-CA脂質體的包封率，連續測定5批脂質體，包封率公式如下：

包封率(CA)=MCA/M×100%

其中，MCA為消解后測得CA的濃度，M為制備時加入的CA的量。

1.2.8 HA-CA脂質體的細胞毒性實驗 分別培養A549細胞(HA受體高表達)和HepG2細胞(HA受體低表達)并接種于96孔板中，當孔板中細胞完全貼壁且處于對數生長期時，以含10%FBS的培養基為空白對照組，以未經藥物處理過的細胞懸液為陰性對照組，加入3個濃度(5、15、30 μL/mL)的游離CA、CA脂質體及HA-CA脂質體。繼續培養48 h后取出，每孔加入MTT溶液20 μL(20 g/L)，再放回孵箱中繼續孵育4 h。離心，棄上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm 處測定各孔的光密度(OD)值。計算空白脂質體、游離CA、CA脂質體抑制率，以及HA-CA脂質體對A549、HepG2細胞的增殖抑制率，計算公式如下：

細胞抑制率=[1-(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD陰性對照組-OD空白對照組)]×100%

1.2.9 細胞攝取實驗

1.2.9.1 載6-香豆素的脂質體(C-LP)制備 精密稱取6-香豆素0.5 mg于10 mL容量瓶中，加二氯甲烷溶解，配制成0.05 g/L的6-香豆素儲備液。另精密稱取卵磷脂120 mg，膽固醇30 mg(磷脂比為4∶1)，加入氯仿丙酮混合溶劑10 mL(氯仿∶丙酮體積比為4∶1)，超聲使其充分溶解，加入1 mL香豆素溶液，置于旋轉蒸發儀中將溶劑蒸出，直至在瓶壁上形成均勻的脂質膜。加入5 mL(pH 7.4)PBS后在60 ℃水浴條件下水化1 h，即得。

1.2.9.2 載6-香豆素的HA脂質體(HA-C-LP)制備 另精密稱取卵磷脂120 mg，膽固醇30 mg(磷脂比為4∶1)，加入氯仿丙酮混合溶劑10 mL(氯仿：丙酮體積比為4∶1)，超聲使其充分溶解，加入1 mL香豆素儲備液，置于旋轉蒸發儀中將溶劑蒸出，直至在瓶壁上形成均勻的脂質膜。加入3 mL(pH 7.4)PBS和2 mL HA-DOPE的PBS溶液(HA-DOPE為1 g/L)后在60 ℃水浴條件下水化1 h，即得。

1.2.9.3 細胞攝取實驗 分別將培養24 h的A549、HepG2細胞懸液(密度為10×104個/mL)棄去培養基，將4組藥液：6-香豆素DMSO溶液(6-coumarin)、C-LP、HA-C-LP+HA溶液(HA為0.4 g/L)、HA-C-LP，每孔加入1 mL，繼續于37 ℃孵育2 h[10]；棄去培養基，并以冷的PBS洗2次；再以4 %多聚甲醛固定10 min；再用冷的PBS洗2次；以Hochest 33258 (2.5 μg/mL)染細胞核15 min后，再以PBS洗1次，最后置于高內涵儀中分析結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HA-CA脂質體的粒徑測定結果 取脂質體適量，用超純水稀釋后用動態光散射粒徑分析儀測定粒徑，測得平均粒徑、多分散系數(PDI)，結果見圖1。平均粒徑為219.20 nm，PDI為0.16，粒徑分布較窄，脂質體粒徑較均勻。

2.2 CA的標準曲線 以CA的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線得CA的標準曲線方程Y=14 064X-103.54，R2=0.999 1，CA在0.10～0.8 g/L時線性關系良好，見圖2。

圖1 粒徑分布圖

圖2 CA的標準曲線

2.3 精密度及穩定性實驗結果 精密度的RSD為1.63%(n=6)，表明儀器精密度良好；穩定性的RSD為1.71%(n=6)，表明CA樣品在15 h內穩定性良好，見表1。

表1 精密度和穩定性實驗結果

2.4 回收率及HA-CA脂質體包封率的測定結果 3次測得的回收率分別為98.20%、98.50%、98.10%。得到HA-CA脂質體的包封率為(85.36±1.01)%。

2.5 HA-CA脂質體的細胞毒性實驗結果 隨著藥物濃度的增加對A549、HepG2細胞的增殖抑制率增強。在相同給藥濃度下，HA-CA脂質體對A549細胞的增殖抑制作用明顯強于CA脂質體(P<0.05)；而對于HepG2細胞HA-CA脂質體的增殖抑制作用與CA脂質體相當，見圖3。

a:P<0.05,與HA-CA脂質體比較

圖3 細胞抑制率(48 h)

2.6 細胞攝取實驗結果 A549、HepG2兩種細胞在陰性對照組、6-coumarin組和C-LP組的熒光攝取值比較，差異無統計學意義(P>0.05);兩種細胞在6-coumarin組和C-LP組的熒光值略有差異，原因是細胞對于6-coumarin和C-LP兩種藥物的攝取方式存在區別。A549細胞在HA-C-LP組的熒光值遠高于C-LP組(P<0.05)，而HepG2細胞在HA-C-LP組與C-LP組的熒光值比較差異無統計學意義(P>0.05)，A549細胞在HA-C-LP+HA組隨著游離HA的加入導致其熒光值比HA-C-LP組有所下降，見圖4、5。

1：陰性對照組；2：6-coumarin組；3：C-LP組；4：HA-C-LP+HA組；5：HA-C-LP組；a:P<0.05，與HA-C-LP組比較

圖4 細胞攝取熒光值

圖5 細胞攝取熒光圖

3 討 論

惡性腫瘤已經成為威脅人類生命安全的第二大疾病，而且呈現高發趨勢[12]。目前治療腫瘤的手段主要包括手術、放射治療和化學藥物治療等。但放化療的不良反應大，易產生耐藥性[13]。由于中醫藥及中藥成分在治療腫瘤方面，可以發揮多途徑、多靶點作用，同時具有不良反應少、機體耐受性好等優勢，使其成為腫瘤治療的熱點[14]。CA作為中藥成分酚酸類的代表，研究表明可以通過誘導細胞凋亡調節細胞信號轉導、誘導細胞分化和抑制多種與細胞凋亡相關的酶活性等途徑發揮抗腫瘤作用[15]。

由于HA具有良好的可降解性、非免疫原性和生物相溶性，使其介導的抗腫瘤靶向給藥系統研究得到廣泛關注。HA有三種常用方式作為抗腫瘤靶向給藥系統，一是HA-藥物偶聯物，是將藥物與HA通過共價鍵的方式結合；二是HA基因藥物載體，既可保護DNA又可減少不良反應出現；三是HA的表面修飾，用HA及其衍生物修飾納米給藥系統既增強了納米制劑的靶向性，又延長了藥物體內作用時間[16]。

本文以HA為主動靶向配體，脂質體為藥物載體，構建了HA修飾的CA脂質體，用以改善CA自身理化性質的局限，從而達到增強CA抑制腫瘤作用的目的。結果顯示，與游離CA相比，將CA包載至脂質體后的CA脂質體可增強其對A549和HepG2細胞的細胞毒性。另外，HA-CA脂質體對高表達HA受體的A549細胞的細胞毒性明顯大于CA脂質體，而對于低表達HA受體的HepG2細胞而言，HA-CA脂質體與CA脂質體的細胞毒性作用相當，說明HA-CA脂質體由于HA主動靶向配體的加入，使其能主動靶向至HA受體高表達細胞，增強藥物對細胞的毒性作用。細胞攝取實驗同樣證明，HA能夠增強HA受體高表達細胞A549的細胞攝取率，從而提高藥效。關于HA-CA脂質體的主動靶向通路及其體內抑制腫瘤能力等還有待進一步研究。以上研究結果表明HA-CA脂質體是一個很有發展潛力的抗腫瘤藥物遞送系統。

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