EGF對人毛囊外毛根鞘無色素性黑素細胞增殖及遷移能力的影響

袁 睿，杜 宇

(1.重慶市渝北區人民醫院皮膚科 401100；2.西南醫科大學附屬醫院皮膚科，四川瀘州 646600)

白癜風為常見的皮膚，毛發色素脫失性疾病。國內外研究證實多種因素導致白癜風皮損區黑素細胞(melanocytes，MC)消失。但位于毛囊外毛根鞘(out root sheath，ORS)中上部的無色素性黑素細胞(amelanotic melanocytes，AMMCs)并未損傷[1-4]。在外界刺激及自身基因誘導下可作為儲存庫向表皮補充MC[5]。有研究證實表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)除對體內外培養的人皮膚成纖維細胞、角膜上皮細胞有再生作用外，對視網膜干細胞(retinal stem cells，RSCs)[6]、哺乳動物神經干細胞[7]及表皮干細胞都具有促增殖、遷移作用。但其對AMMCs是否有影響尚少見報道。本研究旨在探討EGF能否促進AMMCs的增殖及遷移能力，為白癜風的治療作有益探索。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗標本取自3例頭皮血管瘤患者手術切口邊緣正常頭皮組織(與頭皮提供者溝通獲得同意后，記錄基本信息)。成纖維生長因子(bFGF)、EGF、干細胞生長因子(SCF)購自美國PEPROTECH公司，MCDB153培養基、Chelex 100鈉形式、胰蛋白酶、Geneticin、Cholera toxin購自美國Sigma公司，Dispase Ⅱ購自瑞士Roche公司，CCK-8試劑盒、DAPI染色液購自上海碧云天生物技術有限公司，HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，兔抗NKI/beteb多克隆抗體購自美國Santacruz公司，兔抗HMB45多克隆抗體購自北京博奧森公司，超敏二步法免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司，Transwell遷移小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 螯合血清及ORS中AMMCs專用培養基的配制 螯合血清的配制：在100 mL的10%胎牛血清中加入3 g Chelex 100鈉形式，4 ℃下攪動90 min，除菌后4 ℃保存。ORS中AMMCs專用培養基的配制[8]：將2%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、2.50 ng/mL bFGF、10 ng/mL的SCF、1.66 μg/L的霍亂毒素(CT)、10%的螯合血清、青霉素-鏈霉素溶液(100 U/mL)加入MCDB153培養基中。調定pH為7.10～7.30，濾器除菌后4 ℃保存。

1.2.2 取材和AMMC原代培養 采用聚維酮碘消毒已經取得的頭皮5 min，PBS液反復沖洗3次。放入含青霉素、鏈霉素雙抗溶液的培養基中，用顯微剪去掉真皮上1 mm和脂肪組織，將頭皮被處理成1.00 cm×0.50 cm的皮片。在4 ℃條件下用1%分散酶 Ⅱ 消化皮片24 h，然后在37 ℃條件下繼續消化1 h，再用顯微鑷輕柔擠壓毛囊并使其自動游離。MCDB153培養液反復沖洗3次，1 700 r/min離心7 min，收集毛囊。37 ℃下用0.50%胰蛋白酶消化25～35 min，直至ORS中的細胞絕大多數游離。使用胎牛血清中和并將其制成細胞懸液，經200目銅網過濾，再次1 700 r/min離心7 min。去掉上清液，用AMMC專用培養液將其制成2×107個/mL濃度的細胞懸液，培養于5%CO2，37 ℃的孵箱。

1.2.3 AMMC的純化 繼續將1.2.2中的原代AMMC培養2 d，更換培養液可以除掉未貼壁細胞。然后再培養7 d，在培養瓶中觀察到有小片狀的角質形成細胞后，采用0.25%的胰酶，消化5 min。然后按3∶1的比例傳代。此后每5～7天用1∶2的比例繼續傳代。至第3代時可得到比較純化的AMMC。

1.2.4 AMMC的鑒定 取1.2.3中純化的AMMC，接種于內置有蓋玻片的24孔版中。飽和濕度，5%CO2，37 ℃條件下繼續培養48 h；4%的多聚甲醛室溫下固定15 min；0.5%Triton 室溫下打孔10 min；3%H2O2去離子水孵育10 min；不同的培養孔內分別加入1∶250的兔抗NKI/beteb多克隆抗體、1∶300的兔抗HMB45多克隆抗體、陰性對照(PBS液)，繼續4 ℃下過夜；添加HRP-DAB底物顯色試劑盒內的試劑1，室溫下孵育15～25 min；加入試劑2，室溫下孵育15～25 min；加入DAB溶液，室溫下孵育10 min；加入蘇木素溶液，室溫下復染5 min，添加1%鹽酸乙醇，反應4 s后沖洗，添加飽和LiCO3，反應2 min后沖洗。70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水，顯微鏡下觀察中性樹膠封片后的圖片并記錄。

1.2.5 實驗分組 取經純化及鑒定的AMMC，根據EGF的濃度，把實驗分為5組：即EGF 0、1、10、20、50 ng/mL干預組(分別為對照組、EGF1組、EGF2組、EGF3組、EGF4組)。

1.2.6 CCK8檢測法測定不同濃度EGF對AMMC增殖的影響 取經鑒定及純化的AMMC，用只添加了10%胎牛血清的MCDB153培養液制成1×104個/mL濃度細胞懸液，根據1.2.5中的分組接種到96孔板中，每孔的體積為200 μL。每組接種10個復孔。采用等體積的相同培養基作陰性對照。繼續培養24 h，將相應濃度的EGF分別加入各實驗組 ，每孔加入EGF的體積為20 μL，繼續在飽和濕度、37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。取出96孔板，每孔中加入20 μL體積的CCK8溶液，繼續飽和濕度、37 ℃、5%CO2條件下培養1 h。然后在全光譜分光光度計上檢測，選擇的波長為450 nm。記錄檢測結果，重復3次實驗。

1.2.7 Transwell體外小室遷移實驗測定不同濃度的EGF對ORS中AMMC遷移的影響 取經鑒定及純化的AMMC，培養于無血清的MCDB153中饑餓24 h，然后用2%胎牛血清+MCDB153培養液配成濃度為2×104個/mL的懸浮細胞液。Transwell遷移小室(帶8 μm直徑的微孔聚碳酸酯膜)的上室中加入200 μL上述細胞懸液，下室添加500 μL的10%胎牛血清+MCDB153培養液。各實驗組每孔的上室添加100 μL相應濃度條件的EGF,飽和濕度、37 ℃、5%CO2條件下繼續培養48 h。去除小室濾膜上的細胞，在室溫下用40 g/L的多聚甲醛固定濾膜下的細胞15 min；0.50%Triton室溫下打孔10 min；DAPI室溫下染色3 min(下面的操作均需要避光)。滴18 μL的抗熒光猝滅劑于載玻片上，蓋上蓋玻片，隨機在熒光顯微鏡下取8個400倍視野并記錄細胞數。重復實驗3次。

2 結 果

2.1 ORS中AMMC的免疫組織化學染色結果 第3代經傳代純化的細胞，HMB45免疫組織化學染色顯示，細胞質中沒有棕黃色的顆粒。NKI/beteb免疫組織化學染色,少數細胞為三級，大多數細胞為雙極，細胞質中有棕褐色的顆粒，見圖1。

A：NKI/beteb 染色；B：HMB-45染色

圖1 ORS中AMMC的免疫組織化學染色(×200)

a：P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與EGFI組比較

圖2 各組ORS中AMMC增殖能力比較

A：對照組；B：EGF1組；C：EGF2組；D：EGF3組；E：EGF4組

圖3 人ORS中AMMC遷移實驗(熒光顯微鏡，DAPI×400)

2.2 各組ORS中AMMC增殖能力比較 EGF干預48 h后所檢測到的各組AMMC的CCK8的OD值，經單因素方差分析得出EGF2、EGF3、EGF4組AMMC的OD值均高于EGF1組和對照組(P<0.05)；EGF2、EGF3、EGF4組組間AMMC的OD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；EGF1組和對照組組間的OD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3 各組ORS中AMMC遷移能力比較 EGF干預48 h后測得各組穿過聚碳酸酯膜微孔的AMMC的細胞數，結果檢測到EGF2、EGF3、EGF4組遷移穿過聚碳酸酯膜微孔的AMMC的細胞數明顯多于對照組和EGF1組(P<0.05)；EGF3、EGF4組多于EGF2組(P<0.05)；EGF3、EGF4組組間的遷移細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對照組與 EGF1組AMMC的遷移細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3、4。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與EGF1組比較;c:P<0.05，與EGF2組比較

圖4 各組ORS中AMMC遷移能力比較

3 討 論

白癜風皮損的復色首先在毛囊口形成色素島，然后向四周擴散，最后形成色素片。但在無毛囊的部位如手掌等沒有發現這種復色現象。有研究者將患者正常皮膚的毛發拔取后接種到皮損區并觀察到了以接種毛發為核心的復色[9]。表明在白癜風復色中毛囊起關鍵作用。CUI等[10]于90年代發現AMMC主要位于ORS中上部，光鏡下細胞體大多數小于MC，呈多角形，折光度好，少數為三級結構，多為雙極。一般情況下處于休眠狀態，無黑素合成能力。在如UVB照射、炎癥等刺激下激活，被激活的AMMC分化成熟，遷移至脫色區，形成以毛囊為中心的色素島，從而起到MC儲存庫的作用[11-12]。既然ORS存在無活性的MC，而AMMC又被證實為MC前體，具有干細胞特性，在特定條件下可增殖分化成MC，且有研究表明患者皮損內AMMC并未受到損傷[1-4]。因此，采用刺激AMMC增殖、遷移并分化為成熟的MC從而復色皮損的方法具有較好的應用前景。但是在ORS中AMMC數量極少，怎樣使處于靜息態的AMMC激活、增殖并遷移成為研究白癜風治療中迫切需要解決的難題。細胞增殖的主要方式是細胞分裂，目前已知的有絲分裂原包括bFGF、EGF等，它們能促進細胞的分裂和增殖。bFGF被證實對AMMC的增殖有促進作用。那么同為有絲分裂原的EGF對AMMC的增殖是否也有促進作用？

本研究通過體外實驗采用不同濃度EGF干預經鑒定的AMMC。結果證實EGF 10、20、50 ng/mL干預后的增殖能力高于EGF 0、1 ng/mL(P<0.05)；EGF 0、1 ng/mL干預組間增殖能力比較，差異無統計學意義(P>0.05)。證明EGF需達到一定濃度后才能起到促進增殖作用。但是隨著EGF的濃度升高，促進增殖作用并未進一步增加。

同時，本研究通過體外Transwell 小室遷移實驗發現，與EGF 0、1 ng/mL干預比較，EGF 10、20、50 ng/mL均可促進AMMC的遷移(P<0.05)。說明當達到一定濃度后，隨著EGF濃度的升高，其促遷移的作用并未進一步增加。

綜上所述，一定濃度范圍內的EGF對AMMC具有促進增殖、遷移作用，濃度過高或過低，其促進作用明顯減弱。這對以后的研究提供了可靠依據，但機制尚不清楚。近來有文獻報道EGF受體(EGF receptor,EGFR)在AMMC大量分布的人ORS的隆突區有較強表達[13-14]。這提示EGF可能通過EGFR對AMMC發揮促進增殖和遷移作用，作者將在進一步研究中探討其作用機制，以期為白癜風的治療提供新的思路和治療靶點。

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