GTPBP4對肝細胞癌生物學行為影響及其機制的研究*

章諾貝，陳 新

(南昌大學第二附屬醫院：1.消化內科；2.核醫學科，南昌 330006)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，是全球第五大常見的惡性腫瘤，在我國，HCC的病死率更是高居惡性腫瘤病死率的第2位[1]。HCC的發生、發展是多因素、多階段、多基因相互作用的結果，包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因激活和抑癌基因失活、細胞凋亡和增殖調節失控等。盡管人們對HCC已經進行了大量的研究，但關于HCC發生、發展的確切機制仍有待進一步闡明。GTP連接蛋白(guanosine 5′-triphosphate-binding proteins，GTPBP)是指能與鳥嘌呤核苷酸結合，具有GTP水解酶活性的一類信號轉導蛋白，由α、β、γ 3個不同亞基組成，其在細胞信號傳遞轉導、細胞骨架形成、蛋白質合成等細胞的多種生命活動中均發揮重要作用[2]。GTPBP4是GTPBP家族成員之一，其編碼基因是一廣泛存在于從酵母到人類各種真核生物中的高度保守基因[3]。近來有研究報道，GTPBP4表達減弱可使人結腸癌細胞的增殖受到抑制，而GTPBP4的表達升高又與結腸癌和乳腺癌患者生存率下降有關[4-5]。但關于GTPBP4在HCC發生、發展中作用及其機制的研究仍鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本 75例HCC患者的肝癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，人肝癌組織芯片編號：HLiv-HCC150CS-02。其中，男63例，女12例；年齡34～77歲，平均52.10歲。

1.1.2 人肝癌細胞株 人HCC細胞株SMMC-7721、HEPG2、HUH-7、HEP3B均購自上海吉凱公司。

1.1.3 實驗動物 BALB/cA 裸小鼠，4周齡，購自上海斯泰克實驗動物有限公司[動物合格證號SCXK(滬)2012-0002]，寄養于上海同濟大學實驗動物中心。

1.1.4 主要試劑 10%胎牛血清(FBS)、DMEM購自美國Gibco公司，脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，GTPBP4的小干擾RNA(siRNA)購自上海吉凱公司，RNeasy Mini試劑盒、Sensiscript RT試劑盒購自德國Qiagen公司，SYBR Green PCR Master Mix購自美國Thermo公司，ABI Prism 7900序列檢測系統購自美國應用生物有限公司，蛋白酶抑制劑購自美國Promega公司，裂解緩沖液購自美國Sigma公司，Mini Trans-Blot系統購自美國Bio-Rad公司，聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司，抗GTPBP4抗體、抗CDK6抗體、抗 CCND1抗體、抗CCND2抗體、抗MDM2抗體、抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司，Pierce ECL化學發光底物購自美國Thermo公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.1.5 主要儀器及計算機軟件 倒置顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司，熒光顯微鏡購自日本奧林帕斯公司，Mini Trans-Blot系統、凝膠成像系統購自美國Bio-RAD公司，Cellomics ArrayScan系統購自美國Thermo公司，FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司，高速離心機購自美國Beckman公司，Genechip miRNA v.2.0、miRNAQC軟件購自美國Affymetrix公司，FLOWJO軟件、Genespring 7.2軟件購自美國Agilent公司，TargetScan 軟件(美國)。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的GTPBP4免疫組織化學檢測 GTPBP4 抗體稀釋比例為 1∶6 000，以 PBS作為陰性對照，免疫組織化學采用SP法，烤片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，阻斷滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，正常羊血清工作液封閉37 ℃ 10 min，一抗4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min，生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3× 5 min，DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。

1.2.2 細胞培養和siRNA轉導 細胞在含有10% FBS和100 U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM中進行培養，細胞培養箱條件為5%CO2，37 ℃。 GTPBP4的siRNA雙鏈體如下：5′-CAU GUC GGA CGG UUU CGA UdTdT-3′和5′-GCU GCA AAA GGG GAU GAA GdTdT-3′。應用倒置的4E-TsiRNA作為陰性對照siRNA(Control)。轉導流程按照LipofectamineTM2000進行。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 使用RNeasy Mini Kit從人類HCC細胞系中提取總RNA，為了測量GTPBP4的mRNA水平，使用Sensiscript RT試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix在ABI Prism 7900序列檢測系統上進行qRT-PCR反應。用于擴增GTPBP4的引物如下：正向引物為5′-TCA GGA TCC GCT AAG CCC CAG GTG GTT-3′，反向引物為5′-GGC TCG AGT TAC TGT TTT CGC TTA CG-3′，以GAPDH作為參照物。

1.2.4 Western blot分析 使用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進行細胞裂解，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離含有蛋白質的細胞裂解物，并通過Mini Trans-Blot系統轉移到聚偏二氟乙烯膜。將印跡在TBST制備的5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后將封閉的膜在4 ℃下與以下抗體一起孵育：抗GTPBP4抗體，抗CDK6抗體，抗CCND1抗體，抗CCND2抗體，抗MDM2抗體和抗GAPDH抗體。第2天，將膜洗滌并與偶聯辣根過氧化物酶的第二抗體在室溫下孵育1 h，隨后用TBST洗滌幾次以除去未結合的抗體。最后，使用化學發光進行顯像。GAPDH作為內參。

1.2.5 細胞生長情況檢測 進行3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測定以測量活細胞的相對數量。細胞在siRNA轉導后于96孔板中培養24 h。在指定的時間點，用補充有MTT(0.5 mg/mL)的新鮮培養基替換培養基。使用Cellomics ArrayScan系統測量波長為490 nm的吸光度。綠色熒光蛋白(GFP)表達細胞每天定量1次，持續5 d。

1.2.6 細胞周期檢測 細胞周期檢測首先將細胞重懸于冰冷的PBS中，用碘化丙啶(PI)溶液(50 μg/mL PI，100 μg/mL核糖核酸酶A，0.05% Triton X-100在NaCl/PI中)染色細胞，然后在37 ℃下在黑暗中孵育30 min后測量DNA水平。使用FACS Calibur流式細胞儀觀察DNA水平，并使用FLOWJO軟件進行分析。

1.2.7 細胞凋亡檢測 使用特異性FITC標記AnnexinV/PI的細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀檢測SMMC-7721細胞的凋亡。

1.2.8 細胞克隆形成檢測 用GTPBP4-siRNA或陰性對照siRNA感染SMMC-7721細胞，培養24 h。 然后收集細胞，并以5×102個/孔細胞的密度接種在6孔板中。10 d后，用PBS洗滌細胞，然后用甲醇/乙酸(3∶1)固定，最后用Giemsa染色，在顯微鏡下計數菌落數。

1.2.9 動物實驗 裸鼠右前肢腋下注射感染了GTPBP4-siRNA的SMMC-7721細胞(5×106個/mL，GTPBP4-siRNA組)或陰性對照siRNA感染的SMMC-7721細胞(5×106個/mL，對照組)；在接種細胞成功后，開始對裸鼠的成瘤情況進行觀察，觀察并詳細記錄移植瘤的生長狀況，每隔1天1次，每組為10只裸鼠；皮下注射細胞28 d后，處死裸鼠，計算瘤體大小，對腫瘤的長徑(L)及短徑(W)進行測量，瘤體體積=3.14/6×L×W×W，并且稱取瘤體質量。

1.2.10 MicroRNA芯片分析 使用RNeasy Mini Kit從上述SMMC-7721異種移植腫瘤中提取總RNA，將RNA(2 μg)進行標記并與Genechip miRNA v.2.0微陣列雜交，然后使用miRNAQC軟件對原始數據進行四分位標準化后輸入到Genespring 7.2軟件進行分析。此后，應用方差分析來鑒定對照組和GTPBP4-siRNA組樣品之間差異表達的成熟人類miRNA。

1.2.11 KEGG通路分析 應用TargetScan軟件預測對照組和GTPBP4-siRNA組之間差異表達的成熟人類miRNA的推定靶基因，然后使用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數據庫來分析這些推定的靶基因顯著富集的生物學途徑。

2 結 果

2.1 GTPBP4 蛋白在肝癌組織和癌旁組織中表達水平的比較 GTPBP4蛋白在肝癌組織中表達水平高于癌旁組織(P=0.031，Z=-2.2)，免疫組織化學的典型圖片，見圖1。

A：癌組織；B：癌旁組織

圖1 GTPBP4 的免疫組織化學典型圖片(×400)

A：qRT-PCR測定4種HCC細胞系中GTPBP4 mRNA的表達；B：qRT-PCR評價效果；C：Western blot評價效果；a：P<0.01，與對照組比較

圖2 GTPBP4在肝癌細胞株中的表達

A：細胞熒光顯微鏡照片；B：細胞數量增殖曲線；C：細胞增殖倍數曲線；a：P<0.01，與對照組比較

圖3 GTPBP4表達下調對SMMC-7721細胞增殖的影響

A：GTPBP4 基因表達下調前后細胞流式周期圖及柱狀分析圖；B：GTPBP4基因表達下調前后凋亡峰型圖及柱狀分析圖；C：GTPBP4 基因表達下調前后細胞克隆平板實驗照片及柱狀分析圖；a：P<0.01，與對照組比較

圖4 GTPBP4表達下調對細胞周期、細胞凋亡和集落形成的影響

A：GTPBP4基因表達下調前后裸鼠成瘤實驗照片；B：GTPBP4基因表達下調前后裸鼠成瘤曲線；C：GTPBP4 基因表達下調前后裸鼠成瘤瘤體增長統計圖；a：P<0.01，與對照組比較

圖5 GTPBP4敲除對體外異種移植物致瘤性的影響

2.2 GTPBP4在肝癌細胞株中表達上調及siRNA誘導GTPBP4的表達下調 GTPBP4在4個HCC細胞株(SMMC-7721、HEPG2、HUH-7、HEP3B)中表達均上調(圖2A)。與對照組比較，siRNA誘導GTPBP4敲減后，GTPBP4-siRNA組中GTPBP4 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01，圖2B)。Western blot顯示，siRNA誘導GTPBP4敲減后，細胞中GTPBP4蛋白表達水平也明顯降低，見圖2C。

2.3 GTPBP4 基因表達下調對SMMC-7721 細胞增殖能力的影響 與對照組比較，GTPBP4-siRNA轉導后第4、5天，GTPBP4-siRNA組的細胞增殖速率受到明顯抑制(P<0.01)，見圖3。

2.4 GTPBP4 基因表達下調對SMMC-7721 細胞周期、細胞凋亡及克隆形成能力的影響 與對照組比較， GTPBP4-siRNA組細胞周期發生改變，處于G2期的細胞明顯增多(P<0.01)；而S、G1期的細胞無明顯變化(P>0.05，圖4A)。流式細胞儀檢測發現，GTPBP4-siRNA組中細胞凋亡比例明顯高于對照組(P<0.01，圖4B)。克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力發現，GTPBP4-siRNA組細胞集落數目明顯少于對照組(P<0.01)，見圖4C。

2.5 GTPBP4基因表達下調對SMMC-7721 細胞裸鼠體內成瘤能力的影響 接種細胞 14 d后，對照組肉眼即可見腫瘤小結節形成，GTPBP4-siRNA組在20 d可見腫瘤結節形成。GTPBP4-siRNA組腫瘤生長較對照組緩慢。接種4周后處死小鼠，測量腫瘤體積和質量，與對照組相比，GTPBP4-siRNA組瘤體體積較小，質量較輕，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

2.6 GTPBP4下游應答基因的聚類分析及KEGG途徑分析 使用miRNA微陣列分析檢查對照組和GTPBP4-siRNA組之間差異表達的成熟人類miRNA。聚類分析能夠清楚地區分對照組和GTPBP4-siRNA組腫瘤的miRNA微陣列譜，結果顯示，GTPBP4 敲減后SMMC-7721 細胞內基因發生改變的有333 個，其中上調的有134個，下調的有199 個(圖6A)。然后，應用TargetScan分析來預測對照組和GTPBP4-siRNA組之間差異表達的成熟人類miRNA的推定靶基因。結果顯示，這些推定的靶基因在KEGG途徑數據庫中指定的特定生物學途徑，找到富集差異基因所在的10條信號通路，見圖6B。

A：由GTPBP4表達下調所致的miRNA聚類分析，每行代表不同的miRNA，每列代表單個樣本(n=3)，紅色或綠色分別表示表達升高或表達抑制；B：KEGG途徑分析顯示前10名排名的KEGG途徑

圖6 生物信息學分析

2.7 GTPBP4表達下調后差異表達基因的驗證 基于以上TargetScan分析發現KEGG通路中的細胞基質黏附(focal adhesion)和癌癥相關通路(pathways in cancer)顯著失調，本研究確定了黏附/癌癥相關細胞周期蛋白D通路作為HCC細胞中GTPBP4調控的目標通路。在此基礎上，驗證GTPBP4敲除是否顯著影響4個細胞周期關鍵蛋白(即CDK6、CCND1、CCND2、MDM2)的表達。與對照組比較，GTPBP4-siRNA組細胞CCND1蛋白、MDM2蛋白及CCND2蛋白表達下調，而CDK6蛋白表達上調(P<0.01)，見圖7。

A：CDK6、CCND1、CCND2和MDM2的免疫印跡圖；B：4種蛋白質的相對表達水平；a：P<0.01，與對照組比較

圖7 GTPBP4下游基因的Western blot驗證結果

3 討 論

人類GTPBP4基因位于染色體10p15.2-15.3，其編碼635個氨基酸，與鼠、兔的GTPBP4基因同源體均保持93%的同源性，其中一個與GTP結合的超二級結構GYPNVGKS在酵母、鼠類及人類均保持一致[6]。此前，因發現其在慢性腎臟病中表達發生改變，故也曾被稱為慢性腎衰竭基因(chronic renal failure gene，CRFG)[6]。GTPBP4在核糖體60S的生物發生過程中發揮關鍵作用[7]。有研究發現，將GTPBP4在釀酒酵母中的同源體敲除后釀酒酵母也隨之停止生長，由此現象提示，GTPBP4可能與細胞的生長有關[6]。

本研究表明，GTPBP4 蛋白在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，GTPBP4 mRNA在肝癌細胞株中也呈現高表達狀態，以上結果提示 GTPBP4 可能與HCC的發生、發展有關。為了進一步明確GTPBP4對HCC生物學行為的影響，本研究運用RNA干擾技術下調肝癌細胞株SMMC-7721的GTPBP4基因表達后，發現腫瘤細胞的增殖、克隆形成和裸鼠體內成瘤能力均受到明顯的抑制，細胞的凋亡率明顯增加，細胞周期亦發生改變，以上研究結果進一步顯示GTPBP4可能在HCC的發生、發展過程中發揮重要作用。

GTPBP4 基因表達敲減后，SMMC-7721 細胞內多個基因的表達水平發生改變。KEGG通路富集分析表明，GTPBP4表達下調后表達水平發生改變的基因富集在多條信號通路上，其中與腫瘤發生密切相關的調控細胞周期的數個關鍵基因(CCND1、CCND2、CDK6、MDM2)的表達水平發生明顯改變。

細胞周期蛋白D(CCND/cyclin D)，包括CCND1/cyclin D1、CCND2/cyclin D2、CCND3/cyclin D3與CDK4或CDK6的活性復合物，其可使視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白磷酸化并驅動細胞由G1期進入到S期[8]。此外，Rb在G1期末期還可被細胞周期蛋白ECDK2磷酸化。Rb過磷酸化可促使其對E2F的親和力降低，從而允許E2F的激活和細胞分裂所需的基因轉錄[9]。CCND可使得細胞周期進展與細胞外刺激(如生長因子、營養成分、整合素衍生黏附信號等)相協調[10]。細胞外刺激可通過CCND介導細胞增殖，因此，過表達的CCND或其同源CDKs的過度活化可推動腫瘤生長。在人類癌癥中，CCND1比CCND2或CCND3更容易出現失調。CCND1的過表達可導致CDKs活性的失調，細胞在有絲分裂信號傳導條件下的快速生長，繞過關鍵的細胞檢查點，最終導致腫瘤生長[11]。

CCND1在大部分人類癌癥中均出現過表達和(或)擴增。在多種腫瘤中均出現CCND1基因組的改變，如25%～82%的胰腺癌，約76%的非小細胞肺癌，15%～70%的乳腺癌和55%左右的結腸直腸癌患者[11-15]。在90%以上的套細胞淋巴瘤患者中可出現 t(11;14)(q13;q32)的重排，此重排即可導致CCND1過度表達[12]。30%～50%多發性骨髓瘤患者的CCND1的IgH易位可導致 CCND1的過表達[11]。

CCND2位于染色體12p13，其主要介導細胞外信號與細胞周期進展的相一致[16]。CCND2在調節細胞周期的G1/S轉換中起重要作用[17]。CCND2的過表達已報道與結腸癌和胃癌的進展及預后不良有關[18-19]。此外，CCND2還是Hedgehog和PI3K/Akt信號通路的直接轉錄靶標之一[20-21]。這兩種途徑的異常活化可導致細胞增殖、代謝、生長和存活的失控。

CDKs是絲氨酸/蘇氨酸的家族蛋白激酶，其參與細胞周期、基因轉錄、翻譯和其他生物過程，如，神經發生和凋亡。CDKs的表達失調與腫瘤發生直接相關。CDKs激活依賴其與細胞周期蛋白相結合。到目前為止，至少發現有20個CDKs。 其中，CDK1、CDK2、CDK4和CDK6可調控細胞周期的轉化[22]。CDK6基因位于人類第7號染色體，其可編碼具有326個氨基酸的激酶。此基因在多種類型的癌癥中均出現表達上調。CDK6是參與G1期到S期的細胞周期進程并對細胞分化產生負性調控的CDK6-CCND復合物的催化亞單位。其活性首先出現在G1期中期，以磷酸化方式調節腫瘤抑制蛋白Rb的活性[22]。越來越多的證據表明腫瘤細胞的增殖依賴于CDK6的表達失調。CDK6在哺乳動物細胞增殖中發揮關鍵作用，其有助于驅動細胞進入細胞分裂周期的DNA合成(S)期。CDK6在G1期的酶活性受到由各種細胞外信號(包括刺激性有絲分裂原、抑制性細胞因子、分化誘導物、細胞-細胞接觸等)所誘導表達的細胞周期蛋白所調控。CCND1、CCND2和CCND3單獨或組合地在不同的細胞譜系中差異表達，它們可與CDK6組裝形成具有酶促活性的全酶復合物[23]。

MDM2是p53的最知名的調節劑之一，它是一種E3泛素連接酶，能夠泛素化p53，導致p53發生蛋白酶體降解。MDM2也可通過結合p53的反式激活結構域從而直接抑制p53的轉錄活性[24]。MDM2在體內外均可持續性表達泛素連接酶活性從而導致p53的降解。因此，雖然p53被稱為基因組“守護者” ，而MDM2卻被認為是“基因組守護者”的監護人。在多種類型的腫瘤中，MDM2常處于過表達狀態。MDM2-p53途徑的改變在HCC中十分常見。p53在HCC中的突變主要發生在p53的DNA結合結構域中，導致其與靶基因的序列特異性應答元件親和力降低，從而降低p53誘導的MDM2表達。在正常條件下，MDM2和p53中的關鍵位點不被磷酸化。而MDM2表達的增加可導致p53轉錄活性的直接抑制，并通過逃避細胞周期檢查點控制從而促進致瘤性細胞生長[25]。

本研究結果表明，GTPBP4可影響CCND1、CCND2、CDK6、MDM2這4個調控細胞周期的關鍵基因的表達，而細胞周期調控又與HCC的發生、發展等密切相關[26-27]。因此，有理由認為GTPBP4可通過調控細胞周期從而影響HCC的發生、發展，而針對GTPBP4的靶向治療也許能成為HCC治療的一個新靶點。相信隨著研究的不斷深入，將能為腫瘤的診斷、預后及靶向治療等提供更多更有力的理論依據。

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