甘草甜素對體外誘導的酒精性脂肪肝細胞的影響及機制研究*

卜曉芬，李 駿，朱 虹△

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院：1綜合二科；2重癥醫(yī)學科，武漢 430000)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)是由于長期、過量的乙醇攝入所導致的肝臟受損疾病，主要的病理表現(xiàn)為肝細胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積,并且酒精性肝硬化的預后比較差[1-3]。隨著近些年飲酒人群的增加，AFL越來越受到人們的重視。甘草甜素是從中藥甘草中分離出來的一種五環(huán)三萜皂苷化合物[4]。近年的研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素能夠清除機體內(nèi)多余的氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用從而對肝臟起到保護作用[5-6]。但是關(guān)于甘草甜素在AFL中的作用尚少見報道。因此，本研究采用構(gòu)建體外乙醇誘導的AFL肝細胞模型，觀察甘草甜素對AFL肝細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 尼羅紅貯存液購自美國Sigma Aldrich公司；RIPM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、三酰甘油(TG)測定試劑盒與CCK8試劑盒購自南京建成生物有限公司；核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子γ(PPAR-γ)、含有“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子1(SREBP-1)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)羊抗人多克隆抗體購自Abcam公司；Trizol Reagent購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA擴增試劑盒均購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 正常肝細胞的培養(yǎng) 人正常肝細胞L02細胞用含10%胎牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8篩選乙醇誘導細胞的最佳濃度 實驗分為空白對照組、對照組、實驗組。取處于生長分裂期的細胞，消化后均勻鋪于96孔板中。待細胞完全貼壁向孔板中加入用含1%血清的1640培養(yǎng)基配置的0、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、6.4%、12.8%的乙醇。孵育24 h后，加入10 μL CCK8 ，采用酶標儀450 nm處檢測各孔中吸光度值。

1.2.3 AFL肝細胞模型建立 將實驗分為對照組和誘導組。誘導組加入含3%乙醇的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。對照組0.4%乙醇誘導培養(yǎng)3 d后，換用正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，并以6 d作為周期進行誘導，傳代。在倒置顯微鏡下觀察細胞質(zhì)內(nèi)的變化情況。將細胞分為對照組、繼續(xù)誘導組、脫離乙醇組，甘草甜素組。對照組：用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；繼續(xù)誘導組：加入含0.4%乙醇的培養(yǎng)基誘導；脫離乙醇組：L02細胞經(jīng)乙醇誘導之后換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；甘草甜素組：L02細胞經(jīng)乙醇誘導之后換用含1.2 mmol/L甘草甜素的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4 CCK8篩選甘草甜素處理細胞的最佳濃度 實驗分組同1.2.2。取處于生長分裂期，乙醇誘導30代的細胞。待細胞完全貼壁后加入含0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L甘草甜素的1%血清的1640培養(yǎng)基，對照組加入不含甘草甜素的1%血清的1640培養(yǎng)基，孵育24 h后，向每孔中加入10 mL CCK8，采用酶標儀450 nm處檢測各孔中吸光度值。

1.2.5 尼羅紅染色檢測細胞內(nèi)脂肪蓄積 取對數(shù)生長期正常的和經(jīng)乙醇誘導后的L02細胞，接種細胞待培養(yǎng)24 h后。將染料尼羅紅貯存液(1 000 μg/mL)用PBS以1∶100稀釋比例稀釋后滴加至蓋玻片上，避光孵育5 min。通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)脂肪的蓄積程度。

1.2.5 細胞ALT和AST泄漏量的測定 分別取對數(shù)生長期的各組細胞，經(jīng)胰酶消化后，1 500 r/min，離心5 min后取各組細胞上清液，嚴格按照ALT和AST試劑盒上的說明書操作。

1.2.6 細胞內(nèi)TG水平的測定 分別取對數(shù)生長期的各組細胞，胰酶消化后1 500 r/min，離心5 min。PBS清洗細胞2次，每次5 min，計數(shù)，控制細胞密度為106個/mL。向各組細胞中加入1 mL裂解液，裂解30 min后，4 ℃離心25 min，收集各組細胞的上清液送于本院檢驗科進行檢測。

1.2.7 流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡情況 取各組中處于對數(shù)生長期的細胞，消化離心后制成單細胞懸液，加入500 μL binding-buffer重懸，依次加入Annexin-V、PI各5 μL。于1 h內(nèi)在FCM上檢測。結(jié)果判定：FITC-/PI-為活細胞，F(xiàn)ITC-/PI+為壞死細胞，F(xiàn)ITC+/PI-為早期凋亡細胞，F(xiàn)ITC+/PI+為晚期凋亡細胞。細胞凋亡率計算公式如下：

細胞凋亡率(%)=(早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù))/全部細胞數(shù)×100%。

1.2.8 FCM檢測細胞周期情況 取各組中處于對數(shù)生長期的細胞，消化離心后制成單細胞懸液，加入含75%乙醇的1×binding buffer重懸，4 ℃固定12 h以上，加入RNaseA反應30 min，5 μL PI室溫避光反應20 min。于1 h內(nèi)在FCM上檢測。

1.2.9 Western blot檢測細胞PPAR-γ，SREBP-1，SCAP蛋白的表達 取各組中處于對數(shù)生長期的細胞，提取細胞中的總蛋白，采用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，一抗 4 ℃過夜，二抗[IgG(1∶2 000)]37 ℃孵育2 h，最后電化學發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)測蛋白條帶光密度值。

1.2.10 RT-PCR檢測細胞PPAR-γ、SREBP-1、SCAP mRNA的表達 取各組中處于對數(shù)生長期的細胞，提取細胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄并擴增成DNA。PPAR-γ引物序列上游：5′-GCC TGC ATC TCC ACC TTA TTA-3′,下游:5′-ATC TCC ACA GAC ACG A-3′；SREBP-1引物序列上游：5′-TGG GTT AGA GAA TGT GTT GGT G-3′，下游：5′-GAA GTA GCC GAT GAG GAT GAT G-3′；SCAP引物序列上游：5′-ACA CAG CAA CCA GAA ACT CAA G-3′，下游：5′-AGT GTG TCC TCC ACC TCA GTC T-3′；以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列上游：5′-CAT GGG GTG TGA ACC ATG AGA-3′；下游：5′-GTC TTC TGG GTG GCA GTG AT-3′。RT-PCR反應條件如下：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃變形30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，最后70 ℃延伸10 min結(jié)束。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1 CCK8篩選乙醇誘導細胞的最佳濃度 隨著乙醇濃度的增加，肝細胞的活力隨之降低，活細胞的數(shù)目也逐漸減少，見圖1。

圖1 不同濃度乙醇作用肝細胞的CCK8結(jié)果

2.2 CCK8篩選甘草甜素處理細胞的最佳濃度 隨著甘草甜素處理濃度的增加，細胞活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當作用濃度為1.2 mmol/L時，甘草甜素對細胞的促生長作用最大，見圖2。

圖2 不同濃度甘草甜素作用于AFL肝細胞的CCK8結(jié)果

2.3 各組細胞尼羅紅染色結(jié)果 實驗組肝細胞的脂肪蓄積率為(58.85±5.08)%，對照組為(18.12±4.58)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。尼羅紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFL肝細胞中存在大量脂肪的蓄積，見圖3。

A：實驗組；B：對照組

圖3 尼羅紅染色顯示細胞內(nèi)脂肪蓄積(×20)

2.4 各組細胞TG水平及ALT、AST泄漏量比較 與對照組比較，脫離乙醇組中TG水平有所降低(P>0.05);甘草甜素組細胞內(nèi)的TG水平明顯降低(P<0.01);繼續(xù)誘導組細胞內(nèi)的TG水平有所升高(P>0.05)。與對照組比較，脫離乙醇組細胞內(nèi)的ALT與AST泄漏量降低(P<0.05);繼續(xù)誘導組細胞內(nèi)的ALT與AST泄漏量明顯升高(P<0.05);而甘草甜素組細胞內(nèi)的ALT與AST泄漏量明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.5 各組細胞周期與凋亡情況 對照組中的細胞大部分處于G0/G1期，G2/M期細胞數(shù)目少。與對照組比較，甘草甜素組中的細胞，S期細胞明顯減少，G2/M期細胞增加，各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組相比，甘草甜素組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 各組細胞TG水平及ALT和AST泄漏量 比較

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較

表2 各組細胞周期與凋亡結(jié)果比較(%)

a：P<0.05，與對照組比較

2.6 各組細胞中PPAR-γ、SREBP-1、SCAP蛋白的表達 空白對照組中PPAR-γ、SREBP-1、SCAP蛋白的表達低，在乙醇誘導后的AFL肝細胞中3種蛋白的表達出現(xiàn)了明顯的升高，經(jīng)藥物甘草甜素治療后AFL肝細胞內(nèi)3種蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，見圖4。

2.7 各組細胞中PPAR-γ、SREBP-1、SCAP mRNA的表達 空白對照組中PPAR-γ、SREBP-1、SCAP mRNA的表達低，在乙醇誘導后的AFL肝細胞中3種mRNA的表達出現(xiàn)了明顯的升高(P<0.05)，甘草甜素組肝細胞內(nèi)3種mRNA的表達明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組細胞中 PPAR-γ、SREBP-1、SCAP mRNA表達比較

a：P<0.01，與空白對照組比較；a：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

近些年，多項研究報道關(guān)于甘草甜素在肝炎等肝臟疾病中的作用。研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素能夠?qū)λ穆然颊T導的肝損傷起保護作用,同時臨床上采用甘草甜素的脂質(zhì)體對AFL進行治療[7]。但關(guān)于甘草甜素對酒精性肝損傷的報道少見。

李龍輝等[8]報道通過乙醇誘導L02成功建立了體外AFL模型。而本研究采用CCK8法篩選出了對肝臟細胞無明顯損傷作用但又可對細胞活性產(chǎn)生一定影響的乙醇濃度作為亞致死量，通過對誘導前后的細胞進行尼羅紅染色，發(fā)現(xiàn)誘導后的細胞內(nèi)脂肪的蓄積率明顯高于正常的肝臟細胞，傳代后的細胞生長狀況良好，證明建模成功并且模型比較穩(wěn)定[9-10]。

本實驗通過CCK8篩選甘草甜素的作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當作用濃度為1.2 mmol/L時，甘草甜素對細胞的促生長作用最大，因此選取1.2 mmol/L作為最佳濃度。而在本實驗中，亞致死量的乙醇長期作用于肝臟細胞，導致肝細胞受損，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶泄露至培養(yǎng)基中，因此，本實驗通過檢測各組細胞上清液中ALT和AST泄漏量來反映肝臟功能[11-12]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草甜素作用細胞后ALT和AST泄漏量明顯降低(P<0.05)，提示甘草甜素一定程度上能夠減輕AFL的肝臟損傷。乙醇能夠影響肝臟內(nèi)TG的清除導致肝臟內(nèi)大量TG蓄積進而形成脂肪肝[13]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)甘草甜素治療后TG明顯降低(P<0.01)，與動物實驗結(jié)果基本一致[14]。同時本實驗通過FCM檢測了甘草甜素治療后細胞的周期情況，發(fā)現(xiàn)細胞大部分阻滯在G0/G1期，提示甘草甜素對細胞周期影響不大，但是能夠通過降低細胞凋亡率來抑制細胞的增殖。

PPAR-γ是核受體超家族成員中的一員，有研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ在肝臟、腎臟等多種高代謝組織中存在表達，可以通過氧化脂肪酸從而清除肝臟內(nèi)的TG，減少體內(nèi)TG的蓄積[15]。SREBPs是一種重要的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，當細胞內(nèi)固醇減少時，SREBPs與SCAP結(jié)合由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至高爾基體，調(diào)控脂質(zhì)代謝基因的表達，導致體內(nèi)脂質(zhì)的沉積[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，乙醇誘導后的AFL肝細胞PPAR-γ、SREBP-1、SCAP mRNA的表達明顯升高(P<0.01)，經(jīng)甘草甜素治療后3種mRNA的表達出現(xiàn)了明顯下調(diào)(P<0.05)，同時各組細胞中3種蛋白的表達與mRNA表達一致。結(jié)果提示乙醇可以通過調(diào)控PPAR-γ、SREBP-1、SCAP表達促進脂質(zhì)的產(chǎn)生，與YOU等[17]的研究結(jié)果一致；甘草甜素可能通過下調(diào)PPAR-γ、SREBP-1、SCAP表達，從而抑制脂質(zhì)的產(chǎn)生，但是具體的機制還需進一步的研究。

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