腹瀉型感染后IBS患者外周血和結腸黏膜IFN-γ、IL-10表達及臨床意義*

何周桃，孫曉寧，周旭春，黃白麗，陳益耀，鄧桃枝，韓向陽，藍 程△

(1.海南省人民醫院消化內科，海口 570311；2.重慶醫科大學附屬第一醫院消化內科，重慶 400046)

感染后腸易激綜合征(post-infectious irritable bowel syndrome，PI-IBS)與感染后腸道低度炎癥和持續免疫激活有關，但其具體機制并不完全清楚[1-4]。除免疫細胞外，炎癥細胞因子在感染后免疫應答中起著承上啟下的關鍵作用[5-6]。有研究發現IBS細胞因子表達異常可能存在1型輔助T細胞/2型輔助T細胞(Th1/Th2)失衡，但這些細胞因子的變化與IBS臨床癥狀的關系還不太明確[7-9]。本文探討PI-IBS患者外周血和腸黏膜炎癥細胞因子干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-10表達變化及其與臨床癥狀的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1-12月海南省人民醫院門診及住院的腹瀉型PI-IBS患者30例(觀察組)，其中男19例，女11例，年齡28～64歲，平均(43.02±10.73)歲。健康體檢者(行腸鏡檢查黏膜正常者)30例(對照組)，其中男17例，女13例，年齡24～61歲，平均(41.30±11.02)歲。兩組對象性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。PI-IBS患者符合羅馬Ⅲ診斷標準[10]，至少有1次急性腸道感染的病史，未足量足程使用抗菌藥物治療，處于疾病發作期(近1個月內反復腹痛、排便異常等)。30例PI-IBS患者經抗菌藥物治療后，臨床癥狀均獲得不同程度的緩解。患者均行血、尿、糞常規檢查，血液生化檢查，胸腹部影像學檢查及內窺鏡檢查，以排除器質性疾病。排除標準:嚴重心肺疾病及神經內分泌疾病患者;精神疾病患者及特殊人群，如孕期、哺乳期婦女及14歲以下兒童;其他各種原因致依從性差者。所有研究對象入組時簽署知情同意書，研究方案獲得海南省人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 重組人IL-2,IL-23購自美國R&D公司。所有抗體均購自美國BD Bioscience公司。DU530分光光度計為美國Beckman公司產品。人細胞因子ELISA試劑盒為美國R&D公司產品。免疫組織化學試劑盒為武漢博士德公司產品。

1.2.2 外周血單個核細胞(PBMC)的分離培養 采集外周血5 mL，枸櫞酸抗凝，Ficoll離心法分離PBMC，懸于RPMI-1640中，加ConA 10 g/L、IL-2 10 ng/L和IL-23 10 ng/L刺激，37 ℃，5%CO2培養48 h，3 000 r/min 4 ℃離心5 min，取上清液，凍存于-80 ℃冰箱備檢。

1.2.3 結腸黏膜細胞因子表達 采用免疫組織化學染色法檢測結腸黏膜細胞因子表達。受試者行結腸鏡檢查時取近端結腸組織(距回盲部5 cm)，組織超薄冰凍切片，腸組織切片脫蠟至水，一抗為小鼠抗人IFN-γ、 IL-10單克隆IgG抗體，二抗為辣根過氧化物酶(HRP) polymer酶標大鼠抗小鼠多克隆IgG抗體，DAB顯色。所有組化切片統一由同一臺專業相機攝像，用專業圖像分析軟件Image-ProPlus(IPP)6.0 測定陽性染色的平均吸光度(平均吸光度=累積吸光度/面積)。

1.2.4 細胞因子表達水平檢測 外周血和PBMC培養上清中IFN-γ和IL-10 用相應的人IFN-γ、IL-10 ELISA試劑盒測定，按說明書操作。

1.2.5 臨床癥狀積分 在疾病發作期的每天記錄排便次數、排便急促次數、里急后重次數、腹脹時間、腹痛時間、黏液便次數、大便性狀，根據表1 的評分標準計算各癥狀的每日積分，1周后計算平均每天積分[11]。大便性狀評定標準參照Bristol 大便分型[12]。

表1 腹瀉型PI-IBS臨床癥狀積分表

2 結 果

2.1 兩組對象臨床癥狀積分比較 對照組、觀察組臨床癥狀積分分別為(18.07±1.82)、(1.78±0.82)分，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 兩組對象外周血及PBMC分離培養液中細胞因子表達水平比較 兩組對象外周血中IL-10、IFN-γ水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；PBMC分離培養液中IL-10、IFN-γ水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 兩組對象外周血及PBMC分離培養液中細胞因子表達水平比較

a:P<0.01，與對照組比較

2.3 兩組對象結腸黏膜細胞因子表達水平比較 與對照組比較，觀察組結腸黏膜中IL-10水平降低(P<0.01);兩組對象結腸黏膜中IFN-γ水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。IL-10的陽性染色主要位于細胞質內，腸黏膜固有層、腺體周圍，呈黃色或棕色顆粒沉積；IFN-γ的陽性染色主要位于細胞質內，腸黏膜層、腺體周圍，呈黃色或棕色顆粒沉積。兩組對象結腸黏膜細胞因子的表達，見圖1、表3。

圖1 兩組對象結腸黏膜細胞因子的表達表3 兩組對象結腸黏膜細胞因子表達水平 比較

組別IL-10IFN-γ觀察組10.52±2.05a28.16±3.11對照組20.18±3.2115.38±2.26

a：P<0.01，與對照組比較

2.4 觀察組PI-IBS患者細胞因子表達與臨床積分的相關性分析 Spearman相關分析表明，觀察組腸黏膜及PBMC培養上清液中IFN-γ表達水平與臨床癥狀積分呈正相關(r=0.94、0.45，P<0.01)。腸黏膜及PBMC培養上清液中IL-10水平則與臨床癥狀積分呈負相關(r=-0.79、-0.52，P<0.01)。外周血中IL-10、IFN-γ水平與臨床癥狀積分無相關性(r=-0.16、-0.13，P>0.05)，見表4。

表4 觀察組細胞因子表達與臨床積分的相關性分析

3 討 論

IBS被定義為一種功能性腸病，原因在于其缺乏生化和肉眼可見的形態學異常。一些學者試圖尋找IBS發病時的理化和生物學變化以探討其發病機制，并作為疾病進展或風險的指標。有研究報道IBS時細胞因子的變化可能與感染后IBS發病有關[5]；熊青等[13]報道IBS患者外周血miRNA水平變化可能作為疾病的預測指標。但目前還沒有一個較好的疾病觀測指標[14]。

目前研究發現在PI-IBS時，外周血、PBMC及結腸局部的炎癥細胞因子的變化有所不同。何曉榮等[15]報道腹瀉型IBS患者血清IFN-γ水平升高，但IL-10水平無明顯變化；吳萍等[16]報道IBS患者PBMC分泌IFN-γ水平升高，IL-10水平明顯降低。RANA等[17]報道腹瀉型IBS患者血清IL-6、TNF-α水平升高而IL-10水平沒有明顯變化。這些結果不一致的原因還不清楚，有可能是外周血中其他理化和生物學因素互相制衡的緣故。另一方面，外周血和組織局部的情況可能有所差異。

IFN-γ是一種由Th1分泌的主要的促炎性細胞因子，其主要作用是促進Th1和巨噬細胞富含性的炎性反應，抑制Th2和嗜酸性粒細胞富含性的炎性反應[18-19]。IL-10是一種抗炎性與免疫抑制性細胞因子，可通過抑制激活的單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和T淋巴細胞等發揮其功能，在穩定腸道黏膜內環境中起到重要作用。剔除IL-10 基因的小鼠可自發結腸炎，說明IL-10 在腸道正常黏膜免疫平衡調節中發揮著重要作用[20]。

由此可見，機體IFN-γ/IL-10平衡可能是維持局部內環境穩態的作用因素。在疾病狀態下，這一平衡被打破而造成持續的免疫活化和低度炎癥。本研究進一步發現IFN-γ與臨床癥狀呈正相關，IL-10則與臨床癥狀呈負相關，證實了這一推測。SCHMULSON等[21]也認為血清低IL-10水平可能是IBS的獨立預測因素。因此，結腸黏膜細胞因子IFN-γ、IL-10的變化可較好地反映腹瀉型PI-IBS的臨床癥狀，將來可能成為疾病病情的預測和評估指標。

另外趨化因子也參與IBS發病[22]，甚至可能還存在其他細胞因子平衡異常[23]，IFN-γ/IL-10異常可能并不是PI-IBS發病的惟一途徑。細胞因子IFN-γ、IL-10在PI-IBS中變化的細胞來源及其下游事件還有待于進一步深入研究。

[1]ISHIHARA S,TADA Y,FUKUB N,et al.Pathogenesis of irritable bowel syndrome-review regarding associated infection and immune actication[J].Digestion,2013,87(3):204-211.

[2]FUTAGAMI S,ITOH T,SAKAMOTO C.Systematic review with meta-analysis:post-infectious functional dyspepsia[J].Aliment Pharmacol Ther,2015,41(2):177-188.

[3]CHEY W D,KURLANDER J,ESWARAN S.Irritable bowel syndrome:a clinical review[J].JAMA,2015,313(9):949-958.

[4]MAYER E A,LABUS J S,TILLISCH K,et al.Towards a systems view of IBS[J].Nature Reviews Gastroenterol Hepatol,2015,12(10):592-605.

[5]YANG B,ZHOU X,LAN C.Changes of cytokine levels in a mouse model of post-infectious irritable bowel syndrome[J].BMC Gastroenterol,2015,15(1):43-46.

[6]SUNDIN J,RANGEL I,KUMAWAT A K,et al.Aberrant mucosal lymphocyte number and subsets in the colon of post-infectious irritable bowel syndrome patients[J].Scand J Gastroenterol,2014,49(9):1068-1075.

[7]CHANG L,ADEYEMO M,KARAGIANNIDES I,et al.Serum and colonic mucosal immune markers in irritable bowel syndrome[J].Am J Gastroenterol,2012,107(2):262-272

[8]CHEN J,ZHANG Y,DENG Z.Imbalanced Shift of cytokine expression between T helper 1 and T helper 2(Th1/Th2) in intestinal mucosa of patients with post-infectious irritable bowel syndrome[J].BMC Gastroenterol,2012,12(1):91-98.

[9]SUNDIN J,RANGEL I,REPSILBER D,et al.Cytokine response after stimulation with key commensal bacteria differ in post-infectious irritable syndrome(PI-IBS) patients compared to healthy controls[J].PLoS One,2015,10(9):e0134836.

[10]DROSSMAN D A.The functional gastrointestinal disorders and the Rome Ⅲ process[J].Gastroenterology,2006,130(5):1377-1390.

[11]ABBAS Z,YAKOOB J,JAFRI W,et al.Cytokine and clinical response in Saccharomyces boulardii therapy in diarrhea-Dominant irritable bowel syndrome;a randomized trial[J].Eue J Gastroenterol Hepatol,2014,26(6):630-639.

[12]CAROFF D A,EDELSTEIN P H,HAMILTON K,et al.The Bristol stool scale and its relationship to Clostridium difficile infection[J].J Clin Microbiol,2014,52(9):3437-3439.

[13]熊青,許龍,李強,等.IBS患者循環microRNA表達譜[J].世界華人消化雜志,2013,21(5):392-396.

[14]CHIRA A,DUMITRASCU D L.Serum biomarkers for irritable bowel syndrome[J].Clujul Med,2015,88(3):258-264.

[15]何曉榮,田堯,鄭志存,等.腹瀉型腸易激綜合征患者血清炎性細胞因子分析[J].現代醫藥衛生,2013,29(2):180-181.

[16]吳萍,張海燕,張葆,等.腸易激綜合征患者細胞因子的變化及其臨床意義[J].中國醫師雜志,2006,8(10):1406-1407.

[17]RANA S V,SHARMA S,SINHA S K,et al.Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine response in diarrhoea-predominant irritable bowel syndrome patients[J].Trop Gastroenterol,2012,33(4):251-256.

[18]LEES J R.Interferon gamma in autoimmunity:A complicated player on a complex stage[J].Cytokines,2015,74(1):18-26.

[19]ASKENASY N.Interferon and tumor necrosis factor as humoral mechanisms coupling hematopoitic activity to inflammation and injury[J].Blood Rev,2015,29(1):11-15.

[20]WEINSTOCK J V,BLUM A,METWALI A,et al.Substance P regulates Th1-type colitis in IL-10 knockout mice[J].J Immunol,2003,171(7):3762-3767．

[21]SCHMULSON M,PULIDO-LONDON D,RODRIGUEZ O,et al.Lower serum IL-10 is an independent predictor of IBS among volunteers in Mexico[J].Am J Gastroenterol,2012,107(5):747-753.

[22]DARKOH C,COMER L,ZEWDIE G,et al.Chemotactic chemokines are important in the pathogenesis of irritable bowel syndrome[J].PLoS One,2014,9(3):e93144.

[23]BASHASHATI M,REZAEI N,SHAFIEYOUN A,et al.Cytokine imbalance in irritable bowel syndrome:a systematic review and meta-analysis[J].Neurogastroenterol Motil,2014,26(7):1036-1048.