UAS-Hey轉基因果蠅品系的構建與鑒定

劉松年，荊凌華，伍 星，趙 鑫

(河南科技大學臨床醫學院/河南科技大學第一附屬醫院急診科，河南洛陽 471003)

Hey基因(Hairy/E(spl)-related with YRPW motif)屬于堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉錄因子超家族成員，具有bHLH結構域、Orange結構域及羧基末端的YRPW保守四肽。哺乳動物的Hey基因包括Hey1、Hey2、HeyL 3個成員，在發育過程中主要表達于神經系統、心臟、血管、體節等組織，作為Notch信號通路的直接靶基因參與神經發生、心血管系統形成及骨骼發育等[1-3]。有研究表明，Hey1基因高表達與膠質瘤的病理發生和侵襲密切相關[4]；Hey2基因敲除小鼠出現明顯的心血管缺損表型，包括法洛四聯癥、膜性室間隔缺損、心室肥大等畸形，出生數天后大部分純合缺失小鼠即死于心力衰竭[5]。系統研究Hey基因的功能和調控網絡，闡明其突變或異常表達的致病機制，可以更好地揭示Hey基因所參與的生物學過程，為其在臨床治療中的應用提供理論依據。然而作為哺乳動物Hey基因相對應的同源基因，果蠅Hey基因的功能尚未系統研究[6-7]。序列比對分析發現果蠅Hey與哺乳動物Hey的bHLH結構域具有97%的序列相似性，因此，研究果蠅Hey基因的功能和調控將為哺乳動物Hey基因的相關研究提供借鑒。GAL4/UAS表達系統利用組織特異性啟動子或增強子活化酵母轉錄激活因子GAL4的表達，隨后GAL4蛋白特異性結合融合有靶基因的UAS，從而調控靶基因在特定組織特定時期過量表達，因而是研究基因功能的有力工具[8]。本研究運用分子克隆和顯微注射技術構建UAS-Hey轉基因果蠅，為運用GAL4/UAS系統過量表達Hey基因，進一步研究Hey基因在發育中的功能和調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 W1118野生型果蠅、elav-GAL4果蠅品系、B1/CyO;TM2/TM6B雙平衡果蠅品系和pUAST載體為本實驗室保存，兔抗Hey多克隆抗體由本實驗室制備。cDNA合成試劑盒、高保真PCR擴增試劑盒、限制酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ、堿性磷酸酶、T4連接酶、DNA相對分子質量Marker、凝膠回收試劑盒、DH5α感受態細胞、質粒純化試劑盒等購自TaKaRa公司；組織裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白相對分子質量Marker、硝酸纖維素膜(NCM)、HRP標記的羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒等購自Sangon公司；兔抗β-Tubulin單克隆抗體(ab179513)購自Abcam公司；TRIzol試劑等購自Invitrogen公司；PCR純化試劑盒、質粒Midi提取試劑盒等購自QIAGEN公司；鹵烴油700購自Sigma公司。其他化學試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1果蠅胚胎總RNA提取與質檢 收集胚胎時，將野生型W1118果蠅轉至卵收集籠，供給涂有酵母的葡萄汁培養板。收集20 h后用尼龍膜網收集卵，50%次氯酸鈉溶液處理2 min去除幾丁質外殼，然后用蒸餾水充分沖洗。取100枚胚胎置于1.50 mL離心管中，加入1.00 mL TRIzol試劑后冰上迅速勻漿，然后按照廠家的說明書提取，總RNA樣品于-80 ℃保存備用。Nanodrop檢測RNA樣品的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳評估樣品的完整性。

1.2.2pUAS-Hey重組質粒構建 取質檢合格的RNA樣品作為模板，按照cDNA合成試劑盒的說明書進行逆轉錄反應合成第1鏈cDNA。然后以cDNA合成反應液作為模板，利用PCR技術擴增果蠅Hey基因的編碼序列，并在兩端分別加上EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點，正向引物：GCCGAATTCATG GAT CAC AAC ATG；反向引物： TAACTCGAGTCA ATA GGC CAT CTC，由GENEWIZ公司合成。PCR反應體系(50.00 μL)包括：10×緩沖液(含有Mg2+)5.00 μL，dNTP混和液(2.50 mmol/L)4.00 μL，正、反向引物(10.00 μmol/L)各1.00 μL，模板cDNA(100.00 ng/μL)1.00 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，滅菌蒸餾水37.75 μL。PCR擴增程序為94 ℃解鏈4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環；72 ℃延伸8 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。pUAST載體和純化的PCR產物分別用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ于37 ℃酶切2 h，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后利用凝膠回收試劑盒分別回收目的片段。回收產物于20 ℃在T4連接酶作用下連接4 h，連接產物通過熱休克法轉化DH5α感受態細胞，然后涂板培養并進行篩選和擴增。(1)從LB/Amp培養板上挑選單菌落接種至LB/Amp培養液中，37 ℃振蕩培養2 h，以菌液作為模板進行菌落PCR篩選。(2)將陽性菌落培養液轉移至錐形瓶中擴大培養，37 ℃振蕩過夜，利用質粒純化試劑盒提取陽性菌落所包含的質粒，然后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ進行酶切鑒定。經過酶切驗證后送至TaKaRa公司測序，測序正確后利用質粒Midi提取試劑盒抽提，得到高濃度和高純度的pUAS-Hey重組質粒，用于顯微注射。

1.2.3顯微注射與轉基因果蠅篩選、平衡和定位 注射前1 d將約200只W1118果蠅轉至卵收集籠，供給涂有酵母的葡萄汁培養板進行適應。第2天供給新鮮的葡萄汁培養板，避光環境下于25 ℃收集胚胎40 min。室溫下用次氯酸鈉溶液處理胚胎去除外殼，去離子水充分沖洗，然后于18 ℃在顯微鏡下將卵呈線性排列，通過雙面膠粘在載玻片上。在胚胎表面涂一層鹵烴油700保濕，置于倒置顯微鏡下將顯微注射針插入胚胎尾端極細胞部位，注入顯微注射液后迅速退出。其中顯微注射液的配制為pUAS-Hey重組質粒25.00 μg，Δ2-3輔助質粒5.00 μg，注射用緩沖液50.00 μL。將顯微注射后的胚胎置于瓊脂培養基上18 ℃培養，在注射后36～72 h挑取已孵化的幼蟲轉至玉米培養基，于18℃再培養3～4 d，然后轉至25 ℃培養5 d，這段時間及時挑出羽化的雄蠅和處女蠅，分別與W1118品系的處女蠅和雄蠅雜交。雜交后置于25 ℃培養，約10 d后觀察其子代。mini-white標記基因的表達可使野生型W1118果蠅的復眼由白色變為紅色，因此通過觀察子代復眼是否變紅，即可明確目的基因有沒有整合入基因組且處于可表達的區域。篩選出的UAS-Hey轉基因紅眼果蠅分別與B1/CyO、TM2/TM6B雙平衡品系雜交，進行定位和平衡，從而獲得穩定遺傳的轉基因品系，見圖1。

1.2.4轉基因果蠅的PCR驗證 分別提取轉基因果蠅和野生型W1118果蠅的基因組DNA作為模板，選擇pUAST載體通用引物進行PCR擴增，正向引物：5′-GCT TCG TCT ACG GAG CGA CAA TTC AAT TCA AAC-3′，反向引物：5′-GCA GTA GCC TCA TCA TCA CTA GAT GGC ATT TCT TC-3′，由GENEWIZ公司合成。PCR反應體系包括(50.00 μL)：10×緩沖液(含有Mg2+)5.00 μL，dNTP混和液(2.50 mmol/L)4.00 μL，正、反向引物(10.00 μmol/L)各1.00 μL，模板DNA(150.00 ng/μL)1.00 μL，DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，滅菌蒸餾水37.75 μL。PCR擴增程序為94 ℃解鏈4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸8 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

圖1 UAS-Hey轉基因果蠅的平衡和定位

1.2.5Western blot檢測Hey蛋白表達水平 將構建好的UAS-Hey轉基因果蠅與elav-GAL4果蠅品系雜交，使Hey基因靶向表達于神經系統。分別選取UAS-Hey果蠅品系、elav-GAL4/UAS-Hey果蠅品系的成蟲，將其腦組織切下后立即加入組織裂解液勻漿，冰上孵育20 min，14 000×g離心10 min，收集上清液蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度，與蛋白上樣緩沖液混合后100 ℃變性5 min，上樣進行蛋白電泳。電泳結束后將蛋白轉移至NCM，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。然后加入抗Hey抗體(1∶1 000)或抗β-Tubulin抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，HRP標記羊抗兔IgG(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，DAB顯色后采用凝膠成像系統進行圖像采集和灰度分析，生物學重復3次。

2 結 果

2.1總RNA樣品質量檢測結果 提取的RNA質量直接影響后續的實驗結果，因此對總RNA樣品首先進行純度和完整性的檢測。本次實驗所提取的3個總RNA樣品的濃度分別為258.04、238.15、215.88 ng/μL；OD260/280分別為2.03、1.98、2.02，純度符合標準；瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，18S條帶寬而亮，無拖尾和彌散等情況，表明總RNA樣品是完整的，也不存在基因組和鹽成分等污染。另外，Agilent生物分析儀檢測電泳圖的基線均平整。因此，所提取的3個總RNA樣品均可用于后續的逆轉錄PCR擴增。

M：分子量Marker；1～3：總RNA樣品

圖2總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳

2.2pUAS-Hey重組質粒構建結果 利用逆轉錄PCR技術擴增果蠅Hey基因編碼序列，并在兩端分別添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，特異性擴增的PCR產物大小與理論值1.296 kb相符(圖3)。pUAST載體和PCR產物分別用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，回收的酶切產物進行連接、轉化和涂板培養。提取PCR篩選陽性菌落的質粒DNA進行酶切分析， EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后得到1.296 kb的目的片段(圖4)。并對陽性質粒進一步測序鑒定，測序結果與數據庫比對未發現點突變和移碼突變，所構建的pUAS-Hey重組質粒與理論相符。

M：相對分子質量Marker；1～3：逆轉錄PCR擴增產物；4：無模板陰性對照

圖3逆轉錄PCR擴增Hey基因編碼序列

M:相對分子質量Marker；1：pUAS-Hey重組質粒EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切；2：pUAS-Hey重組質粒Xho Ⅰ單酶切；3：未經酶切的pUAS-Hey重組質粒；4：pUAST質粒EcoR Ⅰ單酶切

圖4 pUAS-Hey重組質粒的酶切鑒定

2.3顯微注射和轉基因果蠅平衡與定位 本實驗顯微注射了約1 000枚W1118果蠅胚胎，約10%孵化成幼蟲，最終有60只發育至成蟲。這些成蟲分別與W1118品系雜交，根據復眼是否變紅，在它們的子代中篩選出7個轉基因紅眼品系。分別與雙平衡系雜交進行平衡與定位，結果發現6個轉基因果蠅品系，其P[mini-white,UAS-Hey]整合入第3號染色體，另1個果蠅品系插入到第2號染色體，純化后建立穩定遺傳的品系。

2.4轉基因果蠅的PCR分析結果 分別以W1118果蠅品系和轉基因果蠅品系的基因組DNA，以及pUAS-Hey重組質粒為模板進行PCR擴增檢測。以W1118品系的DNA為模板未擴增出產物，以轉基因果蠅的基因組和pUAS-Hey重組質粒為模板均擴增出1.885 kb的目的片段(圖5)。進一步測序發現該PCR產物包含了Hey基因的編碼序列，且未發現點突變和移碼突變。

M：相對分子質量Marker；1：W1118野生型果蠅；2：pUAS-Hey重組質粒；3～9：轉基因果蠅；10：無模板陰性對照

圖5 UAS-Hey轉基因果蠅品系的PCR分析

2.5Hey蛋白在果蠅腦組織的表達水平 分別提取UAS-Hey果蠅品系、elav-GAL4/UAS-Hey果蠅品系成蟲腦組織總蛋白，通過Western blot檢測Hey蛋白的表達水平，與UAS-Hey果蠅相比，elav-GAL4/UAS-Hey果蠅成蟲腦組織中的Hey蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖6。

a：P<0.05，與UAS-Hey比較

圖6 Hey蛋白在成蟲腦組織的表達水平

3 討 論

GAL4/UAS系統最早是在果蠅中建立的，GAL4基因與融合有UAS的靶基因分別位于不同的果蠅品系中，即GAL4表達品系和UAS-靶基因品系。當這兩個品系雜交使二者處于子代的同一基因組時，GAL4蛋白才能特異結合UAS，促進其下游靶基因過表達。GAL4/UAS系統可用于基因過量表達、RNA干擾篩選、基因表達模式描繪、遺傳突變挽救等，廣泛應用于神經系統、心血管系統、視網膜和肌肉等組織的發育研究[8-10]。目前GAL4/UAS系統已應用到了多個生物類型，包括小鼠、斑馬魚、擬南芥等，被證明是高效的基因功能研究技術，對基因功能注釋發揮著重要作用[11-12]。

果蠅Hey基因是基于小鼠Hey1基因的序列，通過檢索表達序列標簽(EST)數據庫而鑒定出來。序列分析發現Hey具有bHLH結構域和Orange結構域，因此將Hey歸類于bHLH超家族中的Hes/Hey亞家族。哺乳動物的Hey基因表達組織廣泛，通常接受Notch通路的轉導信息，作為轉錄抑制物結合在靶基因的啟動子區抑制其轉錄活性，參與心臟發育、血管發生與重建、神經發生等過程[1,3,13]。原位雜交實驗發現果蠅Hey基因的mRNA主要表達于中樞神經系統的腦和腹神經索；免疫染色表明Hey蛋白主要定位于有絲分裂后的新生神經元和神經膠質細胞，初步的功能分析發現果蠅Hey作為Notch信號的靶基因參與神經節母細胞的不對稱細胞分裂，具體分子機制有待進一步闡明[7]。本實驗結果表明，成功構建了pUAS-Hey重組質粒，與Δ2-3輔助質粒共同顯微注射至野生型果蠅的胚胎，然后通過mini-white標記篩選出了UAS-Hey轉基因紅眼果蠅，并分別進行平衡與定位。pUAST載體包含5個串聯的UAS序列，能夠高效結合GAL4轉錄激活因子，其后依次為hsp70啟動子，多克隆位點，SV40小T抗原內含子和SV40多聚腺苷酸加尾信號。這些特征序列被引入P因子，僅包含了P因子的3′末端和5′末端，因此不能編碼轉座酶，但是兩末端含有轉座酶結合位點。Δ2-3輔助質粒是改造的缺陷型果蠅P因子，能夠編碼轉座酶，但是自身不能移動。在Δ2-3輔助質粒作用下，pUAS-Hey重組質粒中的P[mini-white,UAS-Hey]可以發生轉座，并插入果蠅的基因組中。PCR擴增分析證實了P[mini-white,UAS-Hey]已整合入7個獨立轉基因品系的基因組，且處于可表達的區域，從而使果蠅的復眼表現為紅色。另外，本課題組將構建好的UAS-Hey轉基因品系與GAL4品系雜交，發現轉基因品系在GAL4蛋白作用下能夠促使Hey基因過表達，并且出現了異位剛毛感覺器官等異常表型，表明Hey的過量表達干擾了神經系統的正常發育，本課題組將繼續探索該表型的具體機制。

綜上所述，UAS-Hey轉基因果蠅品系的成功構建為應用GAL4/UAS系統過量表達Hey基因，進一步研究Hey基因在發育過程中的功能及調控機制奠定了基礎，也對哺乳動物Hey基因的相關研究提供參考和借鑒。

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