PD-1、PD-L1在喉癌中的表達及臨床意義

張再興，周尚清

(華北理工大學附屬醫院耳鼻咽喉科，河北唐山 063000)

近年來程序性死亡因子1(programmed death 1，PD-1)與PD配體1(PD ligand 1，PD-L1)在惡性腫瘤中的高表達逐漸引起研究者的關注。PD-1是一種位于淋巴細胞表面的受體蛋白，主要位于T細胞表面，具有負向調節T細胞活性的功能[1]。PD-L1屬于B7家族的成員之一，可以在活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞及其他免疫細胞表面廣泛表達。PD-1與其配體結合后，使下游的脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinse,Syk)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyal inositol 3 kinase,PI3K)發生去磷酸化，從而傳遞抑制性信號，發揮負性調節作用[2-4]。近年來，以PD-1及其配體為靶點的免疫治療顯示出了較好的療效，給晚期肺癌的治療帶來了新的希望[5]。本研究擬通過免疫組織化學(IHC)方法檢測PD-1、PD-L1在喉癌及聲帶息肉組織中的表達情況，并分析兩種蛋白與喉癌患者臨床病理特征的關系，以期探討喉癌發生、發展的可能機制，為進一步認識腫瘤免疫機制和腫瘤的免疫治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院耳鼻咽喉頭頸外科行手術治療并病理證實的初治喉癌患者手術切除組織標本45份(喉癌組)，所有病例術前均未接受放療及化療，另選同期收治的聲帶息肉組織37份作為對照(息肉組)。所有標本均經4%多聚甲醛固定，自動脫水機脫水，石蠟包埋，以4 μm厚度組織切片，備用。

1.2方法

1.2.1實驗方法 主要實驗試劑：PD-1兔抗人單克隆抗體ab137132、PD-L1兔抗人單克隆抗體ab205921購自英國ABCAM公司。喉癌及聲帶息肉組織中PD1、PD-L1蛋白免疫組織化學染色：喉癌組織石蠟切片60 ℃干烤4 h后，常規脫蠟至水，3%過氧化氫浸泡10 min滅活內源性過氧化物酶，然后加入10 mmol/L pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液100 ℃煮沸10 min，進行抗原修復。室溫自然冷卻30 min后加入正常馬血清室溫下封閉20 min，加入一抗兔抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體，按1∶100稀釋，4 ℃過夜，PBS洗3次后加入生物素化二抗室溫30 min，PBS洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素室溫下30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察。聲帶息肉組織石蠟切片處理方法與喉癌組織相同。

1.2.2結果判定 PD-1和PD-L1在組織中陽性顯色評定標準為在細胞膜或細胞質中出現淡黃色至棕褐色顆粒。最終判定PD-1和PD-L1表達結果需結合組織切片的染色強度和陽性細胞百分比來評定陽性表達。染色強度評分如下[2]：細胞膜或細胞質出現淡黃色顆粒為弱染色記1分，出現棕黃色顆粒為中等染色記2分，出現棕褐色顆粒為強染色記3分。隨機選擇5個高倍視野，每個視野100個腫瘤細胞或間質細胞中PD-1或PD-L1陽性顯色強度大于或等于2分的、細胞數目大于或等于5%時，或者陽性顯色強度與陽性細胞數目二者相乘結果大于或等于10%時，則判定為該組織切片PD-1或PD-L1陽性表達。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，PD-1與PD-L1二者之間表達相關性比較及其與臨床病理特征關系分析采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組組織中PD-1的表達比較 喉癌組中PD-1的陽性率為57.78%(26/45)，光鏡下可見腫瘤細胞或腫瘤間質細胞的細胞膜或細胞質出現淡黃色至棕褐色顆粒；腫瘤細胞陽性率為37.78%(17/45)，間質細胞陽性率為51.11%(23/45)。息肉組中PD-1陽性率為8.11%(3/37)。PD-1在喉癌組中陽性率明顯高于息肉組(χ2=19.80，P<0.01)，見圖1。

A：喉癌組織；B：聲帶息肉組織

圖1 PD-1在兩組組織中表達(IHC×200)

2.2兩組組織中PD-L1的表達比較 喉癌組PD-L1的陽性率為66.67%(30/45)，光鏡下可見腫瘤細胞或間質細胞的細胞膜或細胞質出現淡黃色至棕褐色顆粒；腫瘤細胞陽性率為48.89%(22/45)，間質細胞陽性率為42.22%(19/45)。息肉組中PD-L1陽性率為13.51%(5/37)。PD-L1在喉癌組中陽性率明顯高于息肉組(χ2=21.33，P<0.01)。

表1 喉癌組織中PD-1與PD-L1表達的相關性

2.3PD-1、PD-L1在喉癌組織中表達的相關性 45份喉癌組織有26例被判定為PD-1陽性表達，30例被判定為PD-L1陽性表達，26例PD-1陽性表達的喉癌組織有23例PD-L1為陽性表達，3例陰性表達，19例PD-1陰性表達的喉癌組織有7例PD-L1為陽性表達，12例陰性表達。PD-1、PD-L1在喉癌組織的陽性表達呈正相關(P<0.01),見表1。

2.4PD-1及PD-L1在喉癌組織中的表達與臨床病理特征的相關性 PD-1、PD-L1在喉癌組織中的表達與臨床分期和分化程度密切相關(P<0.05)，但與患者年齡、性別、發生部位無關(P>0.05)，見表2。

表2 喉癌組織中PD-1及PD-L1表達與臨床病理特征的關系(n)

3 討 論

PD-1具有抑制機體免疫系統的功能，屬于Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1有兩種結合配體，分別為PD-L1和PD-L2。PD-L2主要表達在活化的樹突狀細胞、巨噬細胞上，其表達較為局限。PD-L1可以在活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞及其他免疫細胞表面廣泛表達，因此PD-L1在體內的作用要遠遠超過PD-L2[6]。研究發現，γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-4、IL-10和粒細胞刺激因子等多種細胞因子可以上調PD-L1的表達[7]。目前已有研究發現PD-1、PD-L1在胃癌、乳腺癌、腎細胞癌、肝癌、口腔鱗癌等腫瘤中表達率明顯增高，部分與TNM分期及預后密切相關[8-11]。腫瘤微環境中PD-L1與PD-1結合后抑制機體的免疫反應，從而腫瘤細胞和其他細胞可以維持PD-L1在機體內較高水平的表達。PD-L1也可以作為保護腫瘤細胞的分子，可以避免腫瘤細胞被細胞毒性T淋巴細胞分解、破壞[12]。在腫瘤微環境中可能采用上調PD-L1在腫瘤細胞中的表達作為一種抑制宿主的免疫反應的方式，由此來逃脫免疫系統對腫瘤細胞的攻擊。PD-1與癌癥的預后關系并無明確的實驗證實，但是，值得注意的是KIM等[13]發現PD-1在肺癌的腫瘤浸潤性淋巴細胞的陽性表達率明顯增高，且PD-1的表達與預后有關。已有相關文獻證實PD-L1在乳腺癌、胃癌的表達與患者的預后不良密切相關[14-15]。

本實驗研究發現喉癌組PD-1、PD-L1表達均高于息肉組，差異有統計學意義(P<0.01)。因此，可以考慮檢測PD-1、PD-L1的表達，這將對于診斷喉癌具有輔助作用。本實驗研究發現PD-1表達的腫瘤細胞及淋巴細胞區域PD-L1也多同樣高表達，因此PD-1在喉癌組織中表達情況與PD-L1表達情況密切相關。通過對比喉癌的臨床病理特征及PD-1、PD-L1在喉癌組織中的表達情況，發現PD-1、PD-L1在喉癌中的表達情況與喉癌的臨床分期與組織分化程度密切相關。Ⅲ、Ⅳ期喉癌組織PD-1、PD-L1的陽性表達率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05),由此可以考慮隨著腫瘤臨床分期增高PD-1、PD-L1的陽性表達率也明顯增高，這與文獻報道基本相符[4,15]。高、中、低分化喉癌組織PD-1、PD-L1的陽性表達率有逐漸降低的趨勢，且三者間比較差異有統計學意義(P<0.05)，表明腫瘤的分化程度與PD-1、PD-L1的表達密切相關。

綜上所述，PD-1與PD-L1可能在喉癌的發生、發展過程中發揮重要作用，兩種蛋白表達與喉癌的臨床分期及分化程度密切相關。有關PD-1/PD-L1分子通路在喉癌中的作用有待進一步研究。

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