pSS患者血清TNF-α、TGF-β1水平與唇腺淋巴細胞浸潤程度及ILD的相關性研究

楊 敏，梁勝翔，洪夢琴，許 佳，林 靜

(1.桂林醫學院附屬醫院風濕免疫科，廣西桂林 541001；2.第三軍醫大學預防醫學院，重慶 400038；3.桂林醫學院附屬醫院病理科，廣西桂林 541001)

原發性干燥綜合征(primary Sjogren′s syndrome,pSS)是一種主要累及全身外分泌腺的慢性自身免疫性疾病，病理上以淋巴細胞浸潤為主要特征。隨著病情進展可出現肺、腎、肝等多系統器官損害，以肺間質病變(interstitial lung disease，ILD)最為常見，發生率為9%～75%[1]。ILD發生早期往往無臨床癥狀，難以察覺。目前，臨床上主要通過肺高分辨率CT(HRCT)檢查早期確診ILD，費用較高，并可增加患者放射線暴露風險。因此，尋找一些簡便易行的方法早期初篩ILD具有重要意義。既往研究發現，血清轉化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平與pSS發病密切相關[2-3]。但TNF-α、TGF-β1水平與pSS不同發展階段的關系鮮有報道。本研究通過觀察pSS患者血清TNF-α、TGF-β1水平的變化，并分析其與唇腺病理分級、ILD臨床分期的關系，進而探討外周血TNF-α、TGF-β1表達與pSS內臟損害的相關性，旨在為早期篩查ILD提供敏感、可靠的預測指標，為此類患者的早期干預治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年6月至2016年6月在桂林醫學院附屬醫院風濕免疫科住院初診為pSS的患者116例，其中，男12例，女104例；年齡21～58歲，平均(44.8±11.4)歲。納入標準：(1)均為首診首治患者，未接受激素及免疫抑制劑治療；(2)pSS診斷均符合2002年修訂的pSS國際分類(診斷)標準[4]；(3)均同意參加本課題及隨訪，并簽署知情同意書；(4)pSS合并ILD(pSS-ILD)的診斷符合2000年美國胸科協會(ATS)和歐洲呼吸協會(ERS)提出的特發性肺纖維化(IPF)診斷標準[5]；(5)醫院倫理委員會批準。同時選擇來自同期該院體檢中心體檢的健康志愿者20例(對照組)，其中，男3例，女17例；年齡23～54歲，平均(36.3±13.7)歲，肝功能、腎功能檢查均正常。排除標準如下，(1)繼發性干燥綜合征(sSS)：具備干燥綜合征臨床癥狀和體征，同時也符合類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性肌炎、系統性硬化或者膽汁性肝硬化的診斷標準；(2)肺結核或結核感染，慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、支氣管擴張癥等呼吸系統疾病，類肉瘤病，發病早于干燥綜合征的淋巴瘤，艾滋病，乙型或丙型肝炎，原發性纖維肌痛，以及其他已知可引起自主神經元病變、干燥性角膜炎或唾液腺腫大的疾病；(3)長期服用激素、金制劑、青霉胺、甲氨蝶呤等抗風濕藥物的患者；(4)未通過醫院倫理委員會批準的病例；(5)失訪和隨訪資料不完整患者。將入選的116例pSS患者按以下分級及分期進行分組，(1)唇腺病理分級：Ⅰ級38例，Ⅱ級18例，Ⅲ級15例，Ⅳ級9例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級為pSS浸潤組(n=80)；無淋巴細胞浸潤36例(pSS無浸潤組)。(2)ILD病變分期：0期68例(單純pSS組)；Ⅰ期23例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期為pSS-ILD組(n=48)。以上各組患者間年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1唇腺病理分級 所有病例在唇腺活檢過程中多點摘取唇腺3～4塊，10%甲醛固定后送該院病理科，常規石蠟包埋、切片，經蘇木素-伊紅(HE)染色后在光學顯微鏡下觀察，由經驗豐富的病理科醫師進行讀片。唇腺標本中每50個或以上淋巴細胞聚集形成一個浸潤灶，平均每4 mm2唇腺組織中浸潤灶數目為浸潤灶指數(focus score，FS)[4]。每例標本均由不同病理科醫師檢測3次，取平均值。按照CHSHOLM等[6]標準進行病理分級，Ⅰ級：浸潤灶1個/4 mm2；Ⅱ級：浸潤灶2個/4 mm2；Ⅲ級：浸潤灶3個/4 mm2，Ⅳ級：浸潤灶4個/4 mm2。

1.2.2肺間質纖維化病變分期 根據胸部HRCT，按肺間質纖維化病變嚴重程度分為4期，0期：無明顯ILD；Ⅰ期：病變早期或活動期,表現有磨玻璃影、小葉內間質增多和小葉間隔增厚；Ⅱ期：病變的進展期,有Ⅰ期的表現及界面征、胸膜下弧線影、肺內片狀實變和小結節影；Ⅲ期：病變晚期,有Ⅰ、Ⅱ期及網織影、纖維條索影、蜂窩狀影、牽拉性支氣管擴張和彌漫纖維化[7]。

1.2.3血清TNF-α、TGF-β1測定 于晨起空腹抽取研究對象外周靜脈血約3 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱備用。采用雙抗夾心酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測外周血清中的TNF-α、TGF-β1水平，檢測方法參照該科前期研究的方法進行[3]。

2 結 果

2.1對照組與不同ILD分期pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達水平比較 與對照組比較，單純pSS組、pSS-ILD組血清TNF-α、TGF-β1水平明顯升高(P<0.01)，且pSS-ILD組高于單純pSS組(P<0.01)，見表1。

表1 對照組與不同ILD分期pSS患者血清TNF-α及TGF-β1表達水平比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與單純pSS組比較

2.2對照組與不同唇腺病理分級pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達水平比較 與對照組比較，pSS無浸潤組、pSS浸潤組血清TNF-α、TGF-β1水平明顯升高(P<0.01)，且pSS浸潤組高于pSS無浸潤組(P<0.01)，見表2。

表2 各組對象血清TNF-α、TGF-β1表達水平比較

a:P<0.01，與對照組比較；b:P<0.01，與無浸潤組比較

2.3不同唇腺病理分級pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達水平比較 不同唇腺病理分級的各組pSS患者血清TNF-α、TGF-β1水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。與唇腺病理Ⅰ級比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級pSS患者的血清TNF-α、TGF-β1水平均明顯升高(P<0.01)；Ⅲ級pSS患者的血清TNF-α、TGF-β1水平高于Ⅱ級(P<0.01)，Ⅳ級pSS患者的血清TNF-α、TGF-β1水平高于Ⅲ級(P<0.01)，見表3。

2.4不同ILD分期pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達水平比較 不同ILD分期的各組pSS患者血清TNF-α、TGF-β1水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。與ILD 0期比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期pSS患者的血清TNF-α、TGF-β1水平均明顯升高(P<0.01)；Ⅱ期pSS患者的血清TNF-α、TGF-β1水平高于Ⅰ期(P<0.01)，Ⅲ期pSS患者的血清TNF-α、TGF-β1水平高于Ⅱ期(P<0.01)，見表4。

表3 不同唇腺病理分級pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達水平比較

a:P<0.01，與Ⅰ級比較；b:P<0.01，與Ⅱ級比較；c:P<0.01，與Ⅲ級比較

表4 不同ILD分期pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達的比較

a:P<0.01,與0期比較；b:P<0.01,與Ⅰ期比較；c:P<0.01,與Ⅱ期比較

2.5pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達水平與唇腺病理分級及ILD分期的相關性分析 Spearman等級相關分析發現，TNF-α、TGF-β1表達均與唇腺病理分級及ILD分期的嚴重程度呈正相關(P<0.01)，唇腺淋巴細胞浸潤程度越高，TNF-α、TGF-β1的表達水平赿高；ILD分期越高，TNF-α、TGF-β1的表達水平也越高，見表5。

表5 TNF-α、TGF-β1與唇腺病理分級及ILD分期的相關分析

2.6pSS患者血清TNF-α與TGF-β1表達水平的相關性分析 Pearson相關分析顯示，pSS患者血清TNF-α與TGF-β1的相對表達量呈正相關(r=0.857，P=0.000)。

3 討 論

pSS患者合并多系統器官損害是臨床治療中的難點，其致病機制至今未明。深入了解pSS患者血清TNF-α、TGF-β1水平與唇腺病理分級及ILD臨床分期的關系對pSS的診斷及治療具有重要意義。本研究發現，pSS合并ILD患者及pSS合并唇腺淋巴細胞浸潤患者血清TNF-α、TGF-β1水平均明顯升高。提示TNF-α、TGF-β1在pSS疾病的發展過程中扮演重要角色，其與患者唇腺淋巴細胞浸潤及疾病嚴重程度存在相關性。

近年來，能否應用新技術或方法來替代有創性的唇腺活檢，一直是pSS診斷及病情判斷方面亟待解決的問題。既往研究發現，TNF-α在pSS涎腺損害過程中發揮著關鍵作用，可促進腺泡細胞基質金屬蛋白酶2(MMP-2)的分泌，從而引起基底膜降解和腺泡結構破裂[8]。WILLEKE等[9]的研究發現pSS患者外周血TNF-α明顯升高，而且與口眼干燥、反復腮腺腫大等外分泌腺表現、腺體外系統受累癥狀、疾病持續時間及自身抗體滴度等均明顯相關。上述研究表明，TNF-α在pSS患者腺體及腺外表現的發生、發展中起重要作用，并與病情嚴重程度密切相關。TGF-β1在pSS患者唇腺淋巴細胞浸潤中所起的作用尚不明確。MASON等[10]用吸光度測量并用圖像分析發現pSS患者唇腺導管全部TGF-β亞型的表達比正常對照組明顯升高，提示TGF-β在淋巴細胞細胞增殖及淋巴浸潤中起到重要作用。在小鼠動物模型中，TGF-β1的過表達會引發慢性炎癥，從而導致唇腺間質纖維化，最終引起其分泌功能減退[11]。本研究發現，TNF-α、TGF-β1表達與唇腺病理分級呈正相關。結合上述研究分析，TNF-α、TGF-β1的過度表達可能加重淋巴細胞在pSS患者唇腺中的浸潤，TNF-α、TGF-β1產生越多，腺體的破壞程度越嚴重。據此本研究推測，PSS患者唇腺病理分級越高，內臟受累更明顯。因此，在臨床治療中，加強對TNF-α、TGF-β1水平的監測，可以了解患者唇腺淋巴細胞浸潤程度，對指導臨床治療有重要意義。

有研究發現，在肺間質纖維化患者及纖維化動物的整個病程中均出現了血清TNF-α持續性高表達[12-13]，TNF-α高表達的大鼠會發生特發性肺間質纖維化，而在博來霉素誘發試驗中，TNF-α受體敲除的大鼠發生肺纖維化的程度則較輕[14]。TGF-β1是目前已知最強的致纖維化因子，其過表達可促進纖維細胞激活向肌成纖維細胞轉化及肺成纖維細胞增殖，直接致肺纖維化[15]。本研究發現，pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達與ILD分期呈正相關。提示TNF-α、TGF-β1可能參與了pSS患者ILD的發生與發展，其表達水平在一定程度上可反映pSS-ILD患者肺部病變的嚴重程度。本課題組前期研究發現，環磷酰胺治療后，pSS患者外周血及支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1濃度明顯下降，ILD明顯改善[3]。這也證明了TNF-α、TGF-β1在pSS合并ILD中扮演至關重要角色。因此，臨床上應對TNF-α、TGF-β1高表達的pSS患者進行肺HRCT檢查，可早期發現肺部病變并進行治療干預。

本研究還發現TNF-α與TGF-β1的相對表達量呈正相關。SULLIVAN等[16]發現TNF-α能夠激活ERK轉導途徑，同時，TNF-α還能誘導嗜酸性粒細胞和血小板在肺內聚集，從而上調TGF-β1的表達，另一方面，TGF-β1亦可通過對中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等的趨化作用，促進肺纖維化相關細胞因子TNF-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6、等的表達，誘導產生更多TGF-β1[17]。這可能是TNF-α、TGF-β1通過與其他細胞因子的交互作用產生疊加效應，共同參與pSS的發生與發展的機制之一。

綜上所述，本研究發現血清TNF-α、TGF-β1在pSS患者血清中高表達，二者參與了pSS的發病過程。相關性分析發現，血清TNF-α、TGF-β1表達與唇腺病理分級及ILD分期呈正相關,提示pSS患者血清TNF-α、TGF-β1表達增加可能是唇腺結構破壞及合并ILD的原因，在臨床治療中對二者進行監測具有重要意義。但本研究樣本數較少、病例觀察時間短，具體機制尚有待多中心、大樣本的臨床研究進行明確。

[1]NANNINI C,JEBAKUMAR A J,CROWSON C S,et al.Primary Sjogren′s syndrome 1976-2005 and associated interstitial lung disease:a population-based study of incidence and mortality[J].BMJ Open,2013,3(11):e003569.

[2]LEE,S Y,HAN S J,NAM S M,et al.Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients[J].Am J Ophthalmol,2013,156(2):247-253.

[3]ZHANG L,MO H,ZHU M,et al.Effect of cyclophosphamide on cytokines in patients with primary Sj?gren′s syndrome-associated interstitial lung disease in South China[J].Rheumatol Int,2013,33(6):1403-1407.

[4]VITALI C，BOMBARDIERI S,JONSSON R,et al.Classification criteria for Sjogren′s syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group[J].Ann Rheum Dis,2002,61(6):554-558.

[5]KING T E,COSTABEL U,CORDIER J F,et al.Idiopathic pulmonary fibrosis:diagnosis and treatment.International consensus statement[J].Am J Respir Crit Care Med,1999,161(2 Pt 1):646-664.

[6]CHISHOLM D M,MASON D K.Labial salivary gland biopsy in sj?gren′s disease[J].J Clin Pathol,1968,21(5):656-660.

[7]邱建國，潘解萍，喻少波，等.結締組織病肺間質病變高分辨率CT分期的臨床價值[J].實用放射學雜志,2008,24(9):1188-1190,1193.

[8]YOSHIMURA S,NAKAMURA H,HORAI Y,et al.Abnormal distribution of AQP5 in labial salivary glands is associated with poor saliva secretion in patients with Sjogren′s syndrome including neuromyelitis optica complicated patients[J].Mod Rheumatol,2016,26(3):384-390.

[9]WILLEKE P,SCHOTTE H,SCHLüTER B,et al.Interleukin 1beta and tumour necrosis factor alpha secreting cells are increased in the peripheral blood of patients with primary Sj?gren′s syndrome[J].Ann Rheum Dis,2003,62(4):359-362.

[10]MASON G I,HAMBURGER J,BOWMAN S,et al.Salivary gland expression of transforming growth factor beta isoforms in Sjogren′s syndrome and benign lymphoepithelial lesions[J].Mol Pathol,2003,56(1):52-59.

[11]WOODS L T,CAMDEN J M,EL-SAYED F G,et al.Increased expression of TGF-β signaling components in a mouse model of fibrosis induced by submandibular gland duct ligation[J].PLoS One,2015,10(5):e0123641.

[12]GONO T,KANEKO H,KAWAGUCHI Y,et al.Cytokine profiles in polymyositis and dermatomyositis complicated by rapidly progressive or chronic interstitial lung disease[J].Rheumatology(Oxford),2014,53(12):2196-2203．

[13]胡玉潔,李 理,李偉峰,等.依那西普抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化[J].中國病理生理雜志,2013,29(6):1034-1038.

[14]LI X Y,XU X F,HANG J,et al.Effects of the water channel aquaporin 4 deficiency on bleomycin-induced lung fibrosis in mice[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2014,43(3):281-286.

[15]GHATAK S,BOGATKEVICH G S,ATNELISHVILI I,et al.Overexpression of c-Met and CD44v6 receptors contributes to autocrine TGF-beta1 signaling in interstitial lung disease[J].J Biol Chem,2014,289(11):7856-7872.

[16]SULLIVAN D E,FERRIS M,NGUYEN H,et al．TNF-alpha induces TGF-beta1 expression in lung fibroblasts at the transcriptional level via AP-1 activation[J].J Cell Mol Med,2009,13(8B):1866-1876.

[17]TAKEDA Y,TSUJINO K,KIJIMA T,et al．Efficacy and safety of pirfenidone for idiopathic pulmonary fibrosis[J].Patient Prefer Adherence,2014(8):361-370．