類風濕關節炎患者外周血Treg細胞及其分泌IL-35水平檢測與臨床意義

熊怡淞，宋 燕，俞 娟，陳 莉△

(1.成都軍區總醫院檢驗科，成都 610083；2南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇南通 226001)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性破壞性關節病變為特征的全身性自身免疫性疾病，以雙手、腕、膝、踝和足關節的對稱性多關節炎為主要表現，其病因及發病機制目前尚不明確[1]。研究發現CD4+T 細胞亞群失衡及各種細胞因子和炎癥介質的異常表達在RA 發病中起重要作用；CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)具有免疫應答負調節和免疫無反應性兩大功能，在RA發病和進展中起負調控作用[2]，而白細胞介素(IL)-35是Treg細胞發揮最大抑制效應所必需的一種抑制性細胞因子。 IL-35屬于IL-12 細胞因子家族，主要由Treg細胞分泌。小鼠體內實驗表明，體內IL-35 的表達缺失降低了Treg 細胞的抑制功能，與野生型Treg 相比，IL-35 缺陷的Treg 細胞不能控制效應T細胞的增殖[3]。目前國內對RA患者Treg細胞及其所分泌的IL-35的相關研究和報道較少，因此本研究擬觀察RA患者外周血中Treg細胞和IL-35表達及其與臨床指標的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年10月至2016年10月在成都軍區總醫院就診并確診為RA的患者45例(RA組)，均符合1987年美國風濕病學會診斷標準[4]。其中男9例，女36例，年齡22～78歲，部分患者經過抗風濕藥物或激素治療，根據28關節疾病活動度評分(DAS28)評估目前疾病活動程度：DAS28=0.56×(壓痛關節數)1/2+0.28×(腫脹關節數)1/2+0.70×Ln[紅細胞沉降率(ERS)]+0.014×(患者健康狀況評分)。選擇同時期骨關節炎(osteoarthritis，OA)患者22例(OA組)，其中男8例，女14例，年齡38～69歲。選擇同期健康體檢者26例(對照組)，其中男8例，女18例，年齡17～65歲。本研究通過該院倫理委員會批準并已獲得入選對象的知情同意。排除標準：合并其他自身免疫性疾病及高血壓、糖尿病、冠心病、腫瘤性疾病、急慢性感染、傳染性疾病，合并嚴重并發癥，孕婦及哺乳期婦女。

A：根據前向角散射光(FSC)和側向角散射光(SSC)圈出淋巴細胞門LY；B：根據CD4表達圈出CD4+T細胞；C：RA患者CD4+T細胞中foxp3及CD25表達；D：OA患者CD4+T細胞中foxp3及CD25表達；E：健康者CD4+T細胞中foxp3及CD25表達

圖1 FCM檢測外周血Treg表達

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 BD FACSCanto Ⅱ流式細胞檢測儀購自美國BD公司；低速離心機(KDC-40 型)購自河北白洋離心機廠；酶標儀購自美國Bio-rad公司；洗板機405LS購自美國Biotek公司；CD4-FITC熒光單克隆抗體、CD25-PE熒光單克隆抗體、Foxp3-Alexa Fluor?647熒光單克隆抗體、破膜劑(BD Cytofix/Cytoperm)購自美國Becton Dickinson 公司；牛血清清蛋白(BSA)購自瑞士Roche公司；人IL-35細胞因子檢測試劑盒購自美國MyBioSource公司；人淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.2標本采集 采集各組對象空腹靜脈外周血標本，用EDTA-K2抗凝處理，于8 h內分析檢測，用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)，PBS清洗重懸，制成濃度為1.0×107/mL細胞懸液用于流式細胞術(FCM)檢測。全血標本3 000 r/min離心5 min分離血漿用于細胞因子檢測。

1.2.3Treg細胞的檢測 (1)取流式上樣管，加入各6 μL的CD4和CD25單抗及100 μL PBMC懸液，混勻，室溫避光放置20 min；(2)混勻細胞，加入250 μL BD Cytofix/Cytoperm，混勻，4 ℃放置20 min；(3)加入1 mL BD Perm/WashTMbuffer,1 500 r/min水平離心5 min，棄上清液，沾干；(4)重復第3步再洗1遍；(5)將細胞重懸于50 μL BD Perm/WashTMbuffer ，加入foxp3抗體10 μL，混勻，4 ℃放置30～60 min；(6)重復步驟3洗2遍，棄上清液，細胞重懸于500 μL PBS中，用BD FACSCanto ⅡFCM檢測，Diva軟件分析結果。

1.2.4IL-35的檢測 用ELISA方法檢測血漿IL-35水平，操作按試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.13組對象外周血中Treg細胞水平比較 FCM分析Treg表達，見圖1。結果發現，RA組患者外周血中Treg(CD4+CD25+foxp3+T)細胞占CD4+T細胞百分率較對照組明顯升高(P<0.05)；OA組患者Treg表達比RA患者高，但差異無統計學意義(P=0.086)。3組對象foxp3的熒光強度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組對象Treg表達率及foxp3熒光強度的比較

a：P<0.05，與對照組比較

2.2RA患者不同組別外周血Treg細胞水平比較 根據DAS28評分將RA患者分成4組，DAS28評分越高的患者，其外周血Treg細胞數量和foxp3熒光強度越低，Treg百分數在各組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，而foxp3的熒光強度在各組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 RA患者不同DAS28評分Treg表達及foxp3熒光強度的比較

a：P<0.01，與小于2.6分比較；b：P<0.01，與2.6～<3.2分比較；c：P<0.01，與3.2～5.1分比較

2.3轉錄因子foxp3表達與CD25表達的相關性 將CD4+T細胞根據CD25表達熒光強度不同分為P3、P4、P5 3群，分別顯示每群細胞foxp3表達情況(圖2)。foxp3主要表達于高表達CD25的CD4+T細胞，中等程度表達CD25的細胞中也含有少量foxp3陽性細胞。可見foxp3表達與CD25表達呈正相關性。

2.43組對象IL-35水平比較 RA、OA、對照組血漿IL-35分別為(34.22±14.35)、(78.63±24.58)、(67.56±25.43)ng/L，RA組外周血中IL-35水平明顯低于OA組及對照組(P<0.05)；IL-35在RA患者DAS28<2.6分、2.6～<3.2分、3.2～5.1分、>5.1分組分別為(50.53±16.44)、(42.93±13.53)、(7.97±4.52)、(2.70±1.74)ng/L，DAS28評分越高IL-35水平越低，各組間比較差異有統計學意義(F=30.725，P<0.01)，見圖3。

2.5RA患者Treg數量與RA實驗室指標相關性分析 相關性分析發現，RA患者Treg數量與類風濕因子(RF)、C反應蛋白、抗環瓜氨酸肽(CCP)抗體無相關性，而與ESR、DAS28評分呈負相關(r=-0.223、-0.343，P=0.023、0.011)。IL-35水平與DAS28評分呈負相關(r=-0.368，P=0.008)。

圖2 foxp3表達與CD25表達的相關性

a：P<0.05，與RA組比較；b：P<0.01，與小于2.6分比較；c：P<0.01，與2.6～<3.2分比較；d：P<0.01，與3.2～5.1分比較

圖3各組間IL-35水平比較

3 討 論

目前RA病因和發病機制尚不完全清楚，但一般認為與機體的自身免疫耐受被打破有關[5]。Treg細胞是一群具有免疫負調控作用的T淋巴細胞亞群，健康人外周血Treg細胞占CD4+T細胞的5%～10%，其在維持機體自身免疫耐受方面發揮著極為重要的作用[6]。Treg細胞主要通過以下3個方面發揮免疫抑制作用：(1)細胞直接接觸介導抑制;(2)分泌抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β、IL-2等；(3)表達抑制性轉錄因子foxp3[7-9]。

IL-35是IL-12家族成員之一，主要由Treg細胞產生。IL-35由P35亞基和EBI3亞基構成，其中P35亞基與IL-12 P35亞基相同，EBI3亞基與IL-27 EBI3亞基相同。小鼠體內實驗表明，IL-35的表達缺失降低了Treg細胞的抑制功能[3]，與野生型Treg細胞相比，IL-35缺陷的Treg細胞不能控制效應T細胞的增殖。NIEDBALA等[10]證明，構建的EBI3-P35-Fc融合蛋白體外能促進CD4+CD25+Treg細胞增殖，抑制CD4+CD25-T細胞增殖，體外和體內均能抑制Th17細胞的分化，抑制IL-17分泌，增強干擾素γ(IFN-γ)的產生，改善膠原性關節炎(CIA)癥狀。IL-35對CD4+和CD8+T細胞有抑制功能，但僅局限于外周血成熟T細胞。IL-35能誘導CD4+CD39+CD25+T細胞產生IL-10，從而阻止CIA的發生和惡化[11-12]。

本研究發現，RA患者外周血Treg細胞數量增加，但IL-35卻明顯低于對照組，說明具有負向調控功能的IL-35在RA表達降低，免疫耐受遭到破壞。但Treg細胞數量卻增加，有可能其處于免疫“無能”狀態，功能與正常Treg細胞不一致，不能發揮有效的免疫負調控功能。由于本研究中部分RA患者經過治療，不能反映原始的發病狀態，因此通過DAS28評分對RA患者進一步分組研究，發現不同組別Treg和IL-35表達存在較大差異，DAS28評分越高，代表疾病活動度越大，其Treg細胞比例和IL-35表達均降低，說明在疾病活動期，外周血中的Treg細胞數量及功能均受一定程度的抑制，負調控能力減弱，機體處于免疫激活狀態。而疾病恢復期Treg細胞數量和分泌IL-35功能均增強，甚至超過對照組，使機體處于免疫抑制狀態。本研究還發現，Treg細胞與RA病程具有一定相關性，并與ERS和DAS28評分呈負相關，而與RF和C反應蛋白均無相關性。Treg細胞分泌IL-35的水平也與疾病活動度指標DAS28評分呈現負相關關系。

有文獻報道RA患者外周血Treg細胞及IL-35減少，關節液中Treg細胞增加[13-16]。也有研究發現RA患者外周血Treg細胞數量與對照組相比無變化或增高[17-18]。造成這些研究結果差異的可能因素有：(1)RA患者的活動度及不同病程的影響，患者處于風濕病的活動期，其Treg細胞的表達可能降低，而處于非活動期的患者其Treg細胞的表達可能跟健康者相同或者高于健康者。(2)用藥情況，某些患者用藥物治療后，能部分改善機體免疫功能，重建機體對自身抗原的免疫耐受，其中Treg細胞就是重要的負調控細胞，其表達可能會增加[19]。(3)本研究中RA患者Treg表達雖高于對照組，但其IL-35水平降低，說明其發揮正常的免疫抑制能力減弱，可能屬于功能缺陷的Treg細胞。(4)實驗樣本群及抽樣誤差造成的影響。

綜上所述，Treg細胞及其分泌的IL-35有可能是影響RA發生、發展的重要因素，目前，對于此方面的研究尚待進一步完善，若研究清楚這些將對RA的發病及治療提供有力的理論依據。

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