不同方式的輕度跑步機鍛煉對阿爾茨海默鼠認知功能的影響

宋文穎，張家薇，彭 芳，劉俊保

(1.河南應用技術職業學院護理學院，鄭州 450042；2.鄭州澍青醫學高等專科學校臨床醫學系，鄭州 450064；3.鄭州大學人民醫院中醫科，鄭州 450003)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是老年癡呆中最常見的類型，腦部以淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積形成的老年斑、因微管相關蛋白Tau蛋白過度磷酸化而形成神經原纖維纏結等為其主要病理特征，主要臨床表現為進行性認知功能障礙、行為學改變等，病因十分復雜，目前無特效治療方法[1]。臨床上仍以藥物治療為主，但存在治療效果不理想及藥物不良反應等問題。有研究發現，跑步機鍛煉可明顯提高AD患者及AD動物模型的空間認知能力[2-3]。但也有研究表明，跑步機鍛煉是一種強迫型運動方式，低強度的跑步機鍛煉才更有益于改善AD認知及腦部病理，高強度的跑步機鍛煉會對AD鼠形成壓力而導致相反的效果[4-5]。而是否任何形式的輕度跑步機鍛煉都可以改善AD的認知及病理，目前尚屬未知。本研究采用3種不同形式的輕度跑步機鍛煉方法干預AD小鼠模型，旨在從行為功能學水平、組織學水平及生化與分子生物學水平等方面來觀察有規律和無規律輕度跑步機鍛煉對AD鼠認知功能的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 儀器及試劑：六跑道動物跑步機裝置購自北京碩林苑科技有限公司，Aβ40、42 ELISA檢測試劑盒購自賽默飛世爾公司，β-分泌酶與γ-分泌酶ELISA檢測試劑盒購自江蘇菲亞生物公司，勻漿器、1,3-雙(4-氨基苯氧基)苯(TPER)試劑等購自北京鼎國昌盛生物公司，尼氏染色液購自碧云天生物公司，低溫切片機、倒置顯微鏡等購自萊卡公司，RIPA和PMSF蛋白提取試劑、羊抗兔二抗、β-actin、腦源性神經營養因子(BDNF)、絡氨酸激酶受體B(TrkB)、磷酸化TrkB(p-TrkB)兔抗鼠一抗、聚二氟乙烯(PVDF)膜、電泳液、轉膜液、發光試劑等購自上海生工生物公司，垂直電泳槽、轉膜儀、蛋白膜成像分析系統等購自BioRad生物公司，Trizol、PrimeScript反轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒等購自TAKARA生物公司，β-actin、腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)定量PCR引物由上海生工合成。動物：清潔級C57BL/6 APP轉基因AD模型小鼠購自中國協和醫科大學動物所，合籠繁殖，飼養于獨立送風隔離籠具(IVC)。同時期出生的24只雄性6月齡APP+小鼠經PCR分子鑒定后用于本實驗。

1.2方法

1.2.1動物模型與分組 將24只雄性6月齡APP+小鼠分為4組，對照組、有規律鍛煉組(RE組)、無規律不同時刻鍛煉組(ITE組)和無規律不同持續時間鍛煉組(IDDE組)，每組6只。該小鼠模型在5～6月齡(發病早期)開始在腦部海馬區出現Aβ，在8～9月齡(發病期)出現明顯的Aβ沉淀和認知能力損害。

1.2.2跑步機鍛煉 RE組、ITE組和IDDE組小鼠接受為期12周的跑步機鍛煉(速度為10 m/min)，每周5天(周一至周五)。RE組小鼠：固定時間段，每天上午8：00-9：00連續鍛煉1 h；ITE組小鼠：不固定時間段，每天任意連續鍛煉1 h；IDDE組小鼠：不固定持續時間，每天早晨8：00開始，隨機鍛煉0～1 h。各組小鼠正式鍛煉前在跑步機上接受為期3 d的適應練習(每天1 h，速度為10 m/min)。在RE組小鼠進行鍛煉的同時，將對照組小鼠放置在另一靜止的跑步機上1 h。實驗階段為小鼠6～9月齡。

1.2.3Morris水迷宮檢測小鼠空間認知能力 經過12周的跑步機鍛煉，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠空間認知能力變化。小鼠專用Morris水迷宮參數：水池高度為40 cm、直徑120 cm、分4個象限，平臺高度為28 cm、直徑為15 cm，水溫控制在(25±1)℃。將平臺置于第Ⅰ象限，略低于水面。正式實驗前1周為適應練習階段，各組小鼠每天在固定的時間進行入水練習，每次60 s。第8天開始正式測試。首先進行定位航行實驗，每只小鼠從不同象限依次入水，采集器記錄小鼠運動軌跡及逃避潛伏期、穿越平臺次數。然后進行空間探索實驗，撤去平臺，每只小鼠從不同象限依次入水，記錄上述參數。

1.2.4尼氏染色檢測海馬存活神經元 水迷宮實驗結束，小鼠經水合氯醛麻醉、0.9%生理鹽水灌注、4%多聚甲醛固定液灌注后分離腦組織，經過4 ℃、4%多聚甲醛過夜、30%蔗糖溶液孵育48 h，石蠟包埋后采用低溫切片機切取10 μm冠狀切片，每個組織切6張。染色步驟參照試劑盒說明書進行。封片后置于顯微鏡下觀察，參照文獻[6]的方法計數海馬區存活的神經元，存在清晰細胞體及明顯細胞核的細胞作為完整存活的神經元納入計數。

1.2.5ELISA檢測小鼠海馬組織Aβ40、42水平及β-分泌酶、γ-分泌酶活性 水迷宮實驗結束，斷頸處死小鼠，立即分離海馬組織并稱取質量，在勻漿器中加入TPER(含蛋白酶抑制劑)制備腦組織勻漿。勻漿經4 ℃、16 000 r/m離心1 h，收集上清液用于檢測可溶性Aβ40、42水平及β-分泌酶、γ分泌酶活性；沉淀物經70%甲酸重懸，4 ℃、16 000 r/m離心1 h后收集上清液用于檢測不溶性Aβ40、42水平。實驗方法參照ELISA檢測試劑盒說明書。

1.2.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測小鼠海馬組織相關基因mRNA水平 Trizol法提取海馬組織總RNA，經濃度、純度及完整性檢測，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用ABI 7500 實時定量PCR儀進行qRT-PCR反應，檢測Aβ降解相關基因NEP、IDE和MMP-9 mRNA相對表達水平。每管20 μL反應體系。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，40個循環。每個反應重復3次。以β-actin作為內參基因，基因相對表達量計算采用比較Ct法，基因相對表達量倍數變化采用2-ΔΔCt進行計算。觀察熔解曲線以確認PCR反應產物單一性。引物序列如下，見表1。

1.2.7Western blot檢測小鼠海馬組織BDNF、TrkB與p-TrkB蛋白水平 分離小鼠海馬組織，提取總蛋白并測濃度，每個樣本取適量總蛋白加入Loading Buffer，95 ℃水浴10 min使蛋白變性，置于-20 ℃保存。蛋白樣品依次經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉PVDF膜，封閉，一抗及二抗雜交，加上發光試劑，PVDF膜上的蛋白條帶由伯樂成像分析系統掃描并測灰度值。蛋白相對灰度值(%)=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值×100%。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計分析數據。多組間數據比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠空間認知能力比較 與對照組小鼠比較，鍛煉各組小鼠的逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數增加；RE組逃避潛伏期、穿越平臺次數明顯優于其他3組(P<0.05)，IDDE組穿越平臺次數多于對照組(P<0.05)；而對照組、ITE組、IDDE組組間逃避潛伏期比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對照組、ITE組組間穿越平臺次數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

表1 相關基因qRT-PCR引物序列(5′-3′)

A：對照組；B：RE組；C：ITE組；D：IDDE組

圖1 Morris水迷宮實驗結果

2.2各組小鼠海馬組織Aβ40、42水平及β-分泌酶、γ-分泌酶活性比較 與對照組比較，各鍛煉組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、42水平及β-分泌酶、γ-分泌酶活性均有所下降；只有RE組Aβ40、42水平及β-分泌酶、γ-分泌酶活性與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；ITE組、IDDE組與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 各組小鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數比較

a：P<0.05，與RE組比較；b：P<0.05，與對照組比較

表3 各組小鼠海馬組織Aβ40、42水平及β-分泌酶、γ-分泌酶活性比較

a：P<0.05，與對照組比較

2.3各組小鼠海馬組織NEP、IDE及MMP-9 mRNA水平比較 與對照組比較，其他3組小鼠海馬組織中NEP、IDE及MMP-9 mRNA表達水平有所升高；但4組間各指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組小鼠海馬組織NEP、IDE、MMP-9的qRT-PCR檢測結果

A:對照組;B:RE組;C:ITE組;D:IDDE組

圖2小鼠海馬CA1區尼氏染色結果(比例尺=100 μm)

2.4各組小鼠海馬存活神經元比較 對照組、RE組、ITE組、IDDE組小鼠海馬存活神經元數量分別為(96.00±29.00)、(164.00±43.00)、(98.00±16.00)、(113.00±11.00)個。對照組、ITE組和IDDE組小鼠均表現出明顯的海馬神經元損傷，神經元結構不完整，尼氏體明顯減少；而RE組小鼠海馬椎體細胞層致密排列，海馬神經元數量明顯增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。而ITE組與IDDE組小鼠海馬神經元數量均多于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.5各組小鼠海馬組織BDNF、TrkB及p-TrkB蛋白水平比較 與對照組比較，RE組小鼠海馬組織中BDNF、p-TrkB蛋白水平均明顯上調(P<0.05)，TrkB蛋白水平無明顯變化(P>0.05)。對照組、ITE組、IDDE組組間BDNF、TrkB及p-TrkB蛋白水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與RE組比較

圖3小鼠海馬組織Western blot檢測結果

3 討 論

近年來研究發現，跑步鍛煉作為一種簡單易行、經濟實用的行為學方法可有效改善AD的認知功能。既往的動物實驗研究中，常用的跑步鍛煉方式有自由輪跑步鍛煉和跑步機鍛煉，前者已被證實可有效提高AD認知但臨床應用受限，后者更易在臨床上推廣應用。但跑步機鍛煉是一種強迫式被動性鍛煉方式，其對AD的干預效果具有雙重性，一方面因長期鍛煉而提高認知能力，另一方面因對機體造成壓力并影響機體內平衡而損害認知[7]。目前研究表明，相比于高強度的跑步機鍛煉，輕度的跑步機鍛煉因對機體產生的壓力較小而更有效地提高AD的認知能力[8-9]。本研究旨在觀察不同形式的輕度跑步機鍛煉方法對AD鼠的干預效果并探討可能的作用機制。

機體生理節奏紊亂會影響代謝平衡進而損害認知[10]。本研究結果顯示，長期的輕度跑步機鍛煉可提高AD鼠認知能力，且只有RE組干預效果明顯。表明相比無規律的跑步機鍛煉，有規律的跑步機鍛煉可有效改善AD的認知能力。關于AD的發病機制，目前被普遍認可的是Aβ理論，該理論認為，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經β-分泌酶與γ-分泌酶切割產生毒性強的Aβ40與Aβ42，可溶性的Aβ40、42有效地削弱了突觸的結構和功能，由其聚合形成的不溶性的Aβ則主要沉積在腦部海馬區形成老年斑進而損傷神經元，導致認知功能逐漸減退等臨床癥狀[11-12]。本研究發現，輕度有規律的跑步機鍛煉有效降低了海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、42水平及β-分泌酶與γ-分泌酶活性，而對3個降解Aβ相關基因IDE、NEP與MMP-9的mRNA表達水平并無明顯影響。提示輕度有規律跑步機鍛煉減少Aβ40、42是通過抑制Aβ40、42生成和聚合，而不是促進Aβ的降解。此外，本研究尼氏染色結果提示，輕度有規律跑步機鍛煉相比于不規律鍛煉方式對AD鼠海馬神經元具有明顯的保護作用。

BDNF/TrkB信號通路與神經保護及突觸功能密切相關，在突觸可塑性及神經再生中發揮重要的作用[13-14]。本研究結果表明，RE組BDNF和p-TrkB蛋白表達水平較其他3組均明顯升高。提示輕度有規律跑步機鍛煉對AD鼠的神經保護作用可能是通過調節BDNF/TrkB通路而實現。

綜上所述，不同形式的輕度跑步機鍛煉對AD的干預效果明顯不同，輕度有規律跑步機鍛煉可明顯提高AD認知。改善Aβ病理及促進神經元保護可能是輕度有規律跑步機鍛煉有效提高AD認知能力的作用機制。而無規律輕度跑步機鍛煉對AD的干預作用不明顯。該研究為臨床采用跑步機鍛煉來尋求防治AD的有效方法提供參考依據。

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