慢性缺血性腦白質脫髓鞘比格犬模型中Tau蛋白表達及可能原因

章洪智，劉 靜，楊 樹，王多姿，魏 本，郭富強△

(1.電子科技大學醫學院生物醫學工程，成都 610054；2.四川省醫學科學院/四川省人民醫院/電子科技大學附屬醫院神經內科，成都 610072；3.中國人民解放軍成都軍區總醫院神經內科，成都 610083)

據世界衛生組織預測，到2050年中國將成為世界上老齡化最嚴重的國家之一，在老年患者中可常見側腦室周圍腦白質脫髓鞘病變，隨著脫髓鞘病變的進展，可逐漸出現認知、運動、排尿等功能障礙。leukoaraiosis and disability study(LADIS)研究發現重度腦白質脫髓鞘病變患者出現生活能力下降的風險為輕度腦白質脫髓鞘病變患者的兩倍[1]。而目前缺血性腦白質脫髓鞘病變病理機制尚未有學界共識。

腦白質主要由膠質細胞、軸突、髓鞘和血管組成。動脈病變引起的缺血缺氧性損傷是腦白質脫髓鞘病變主要原因之一[2]。缺血性脫髓鞘改變常伴有腦室周圍白質區少突膠質細胞(OLs)變性死亡、髓鞘水平下降等病理改變[3]。有研究發現，缺血后神經元中Tau蛋白(腦內含量最多的微管相關蛋白)過度磷酸化與凋亡現象共存，Tau蛋白也可作為預測和診斷神經退行性疾病的標志[4-5]，Tau蛋白在缺血缺氧后神經細胞的損傷與凋亡現象中扮演重要的角色。為探索Tau蛋白在慢性缺血性腦白質脫髓鞘病理改變中的影響及可能機制，本實驗利用成年比格犬制備慢性缺血性腦白質脫髓鞘模型，蘇木精-伊紅(HE)染色、盧卡斯快藍(luxol fast blue，LFB)染色后觀察腦白質脫髓鞘病變及病變程度，免疫組織化學法(IHC)檢測Tau、神經膠質抗原2(NG2)、2,3-環核苷3-磷酸二酯酶(CNPase)等表達水平，描述慢性腦缺血對OLs分化成熟的影響，分析Tau與NG2、CNPase表達水平之間的關系，探討在慢性缺血性腦白質脫髓鞘病變中Tau蛋白表達水平的變化及可能的原因。

1 材料與方法

1.1材料 動物：健康成年比格犬16只，由四川省人民醫院實驗動物中心提供，年齡1.5～2.0歲，體質量為10～12 kg。主要試劑：LFB染色液購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司；兔多克隆Tau抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔多克隆NG2抗體及兔多克隆CNPase抗體均購自英國abcam艾博抗(上海)貿易有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及慢性腦白質缺血缺氧模型的制備 將16只比格犬按隨機數字表法平均分為A組(假手術組)和B、C、D組(觀察組)，每組4只。參考文獻[6]的方法經顱外制作腦缺血缺氧模型，對A組比格犬術前12 h禁食，4 h禁水，用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸前部去毛消毒后正中切開皮膚5.0 cm左右，然后經頸前肌及筋膜，在胸鎖乳突肌內側鈍性分離出頸總動脈，另一側操作相同。B、C、D組采用兩步手術法。第一步：將B、C、D組的12只比格犬雙側頸總動脈結扎。具體方法：參照假手術組，術后普通飼料喂養1個月。第二步：B組不結扎椎動脈，C組結扎右側椎動脈，D組即結扎犬雙側椎動脈。具體方法：同上術前準備及麻醉后，頸部脫毛消毒,仰臥位固定,于5、6 頸椎間做一切口,正中略偏右,分離各層組織,在頸長肌內下放鈍性分離出椎動脈，另一側同此操作方法。術后16只比格犬全部存活，以普通飼料喂養1個月后處死。

1.2.2標本留取及HE染色、LFB髓鞘染色 將4組比格犬術后普通飼料喂養1個月后處死并留取腦組織，分別取左右兩側側腦室邊緣腦白質，用4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，做好編碼。HE染色及FLB髓鞘染色均采用常規切片、脫蠟、染色、脫水、封固等方法步驟。

1.2.3IHC檢測 防脫片處理：3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)浸泡，撈片后置烤箱60 ℃ 60 min使切片緊密黏附；切片常規脫蠟至水；30%過氧化氫1份+蒸餾水10份混合，室溫10 min以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次；熱修復抗原：將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后，重復1次，冷卻后，PBS(pH 7.2～7.4)洗2次；滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加稀釋的一抗(Tau抗體 1∶200、NG2抗體1∶100、CNPase抗體1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗3次；滴加生物素化山羊抗鼠/兔IgG二抗，37 ℃ 30 min，PBS洗3次；滴加辣根過氧化酶標記鏈霉素卵蛋白試劑 30 min(37 ℃)，PBS洗4次；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒，取1 mL蒸餾水，加試劑盒A、B、C試劑各1滴，混勻后滴加到切片上，室溫顯色，鏡下控制反映時間，一般2 min左右，蒸餾水洗滌；蘇木精輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.4采圖及檢測平均光密度(IOD)值 采用數碼三目顯微攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再根據組織大小及表達情況分別選取3個不重疊區域400倍下采集圖像；后采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定所采集全部圖像的IOD值，對每張切片采集的3張圖像IOD取平均值。

1.2.5評價標準 腦組織脫髓鞘病變程度LFB染色后評分參照文獻[7]的標準：正常神經纖維及髓鞘形態為0分；紊亂的神經纖維、髓鞘染色深淺不一為1分；髓鞘腫脹、斷裂、明顯的液泡形成為2分；有髓神經纖維消失、髓鞘徹底潰變并被吞噬細胞清除、不能再顯示染色陽性表達為3分。Tau蛋白及NG2、CNPase陽性表達均為棕色。

2 結 果

2.1各組動物髓鞘LFB染色評分及HE染色比較 A、B、C、D組LFB染色評分分別為(0.75±0.71)、(1.38±0.06)、(1.63±0.52)、(1.88±0.64)分，與A組比較，各組動物脫髓鞘病變程度均明顯加重(P<0.05)。HE染色可見慢性腦缺血后腦白質明顯脫髓鞘病理改變， A組OLs髓鞘及OLs形態結構正常完整，OLs豐富；B、C、D組中則可見OLs明顯減少及不同程度脫髓鞘表現，如髓鞘腫脹、髓鞘斷裂，變性的髓鞘最后變為中性脂肪，被吞噬細胞吞噬后變成格子細胞，少數可見脂滴空泡或含鐵血黃素沉積等，亦可見隨著缺血程度加重OLS數量明顯減少，見圖1。

圖1 各組動物髓鞘形態(HE，×400)

圖2 各組動物腦白質Tau蛋白表達比較(IHC,×400)

2.2各組動物腦白質Tau蛋白及NG2、CNPase表達比較 與A組比較，B、C、D組Tau蛋白及NG2表達水平明顯增高(P<0.05)；CNPase表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖2～4及表1。

圖3 各組動物腦白質NG2表達比較(IHC,×400)

圖4 各組動物腦白質CNPase表達比較(IHC,×400)

表1 各組動物腦白質Tau蛋白、NG2及CNPase表達比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與A組比較

2.3Tau、NG2及CNPase表達水平相關性分析 對各指標兩兩進行相關性分析結果顯示，Tau與NG2的表達水平呈正相關(r=0.277，P=0.006)；Tau、NG2與CNPase的表達水平呈負相關(r=-0.303、-0.402，P=0.003、0.001)。

3 討 論

從解剖學特點來看，腦室周圍的深部白質主要通過穿支動脈供血,很少或者完全沒有側支循環可供代償,這決定了其易受腦缺血缺氧的影響。有研究發現腦缺血患者較健康者在各個腦組織部位都有更多腦白質脫髓鞘改變[8]。本研究通過HE染色從病理形態學證實了慢性腦缺血缺氧會引起腦白質脫髓鞘病理改變，對LFB髓鞘染色后對脫髓鞘病變評分結果表明，B、C、D組中脫髓鞘病變程度均加重(P<0.05)，說明慢性腦缺血缺氧可導致腦白質脫髓鞘。

有研究表明，缺血缺氧引起的腦白質病變可能為腦缺血引起OLs的損傷所致[9]，OLs是中樞神經系統髓鞘形成細胞。Tau蛋白在窒息缺氧后新生兒血清中的表達水平可預測神經系統損傷預后[10],高靈敏度的Tau蛋白檢測可對缺氧性腦損傷后的腦功能進行評估和預測[11]。

Tau蛋白在軸突的通信傳導和神經系統的形成中有至關重要的作用，軸索延伸刺激Tau蛋白在髓鞘細胞中表達，其DNA通過轉錄翻譯可促進髓鞘形成[12]。在大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)動物模型中，Tau蛋白在OLS中的陽性表達增強6～8倍[13]。本研究結果顯示，B、C、D組中Tau蛋白的表達較A組表達明顯增加(P<0.05)，且隨缺血程度加重Tau的表達水平亦明顯升高。少突膠質前體細胞(OPCs)可分化為OLS、星狀膠質細胞和小膠質細胞，NG2是分化早期OPCs重要的免疫性標記物。腦室周圍白質OPCs中有NG2表達的細胞數量占大多數[14]。NG2細胞對缺氧缺血損傷高度敏感，通過使早產動物缺氧缺血建立腦室周圍白質損傷(PWMID)模型，形成選擇性腦白質損傷，發現NG2細胞加速形成，但多不分化為OLS，亦不形成髓鞘[15]。

目前認為Tau蛋白在OLs尤其是OPCs中表達,并參與調控髓鞘化進程，為進一步闡明Tau蛋白在OLS中的作用，VERONIKA等[16]通過下調Tau蛋白siRNA的技術，發現Tau蛋白的缺失導致了髓鞘堿性蛋白(MBP)的表達減少。有研究也發現MBP mRNA到遠端細胞的擴展運輸受損且細胞仍然維持在NG2階段[17]。本研究在缺血缺氧的B、C、D組中NG2表達水平較A組明顯增加(P<0.05)，這說明慢性腦缺血損傷時OPCs表達水平增高。

CNPase為一種髓鞘形成相關蛋白，特異性地表達在OLs中,被廣泛用于標記OLs。相較于MBP和蛋白脂質蛋白(PLP)等髓鞘蛋白，CNPase在OLs的表達更早出現，在病理狀態下OPCs的分化成熟障礙、髓鞘形成減少均會導致CNPase的減少[17-18]。本研究中B、C、D組較A組CNPase的表達水平降低(P<0.05)，結合NG2表達水平的變化，可以說明在慢性腦缺血時OPCs存在分化成熟障礙。通過對各組動物Tau、NG2、CNPase在側腦室邊緣白質表達水平進行Pearson線性相關性分析，Tau與NG2的表達水平呈正相關，NG2與CNPase的表達水平呈負相關，提示Tau蛋白在慢性腦缺血時的高表達可能與OPCs分化成熟障礙相關。SEIBERLICH等[19]研究也發現，Tau蛋白的平衡失調會導致OLS分化異常，以及神經膠質細胞的接觸形成和髓鞘早期形成過程的異常。

綜上所述，Tau蛋白在慢性缺血性腦白質脫髓鞘比格犬模型中的表達增加，可能與OPS分化成熟障礙相關。本研究結果為今后脫髓鞘病理機制研究提供了一定的參考和可能的方向。

[1]INZITARI D,PRACUCCI G,POGGESI A，et al.Changes in white matter as determinant of global functional decline in older independent outpatients:three year follow-up of LADIS(leukoaraiosis and disability) study cohor[J].BMJ,2009,339(7715):b2477.

[2]PANTONI L,GARCIA J H.Pathogenesis of leukoaraiosis:a review[J].Stroke,1997,28(3):652-659.

[3]BOWLER V.Editorial commet-The progression of leukoaraiosis[J].Stroke,2003,34(8):1916-1917.

[4]WEN Y,YANG S,LIU R.Transient cerebral ischemia induces aberrant neuronal cell cycle re-entry and Alzheimer′s disease-like tauopathy in female rats[J].Biol Chem，2004,279(21):22684-22692.

[5]SCHRAEN-MASCHKE S，SERGEANT N，DHAENENS C,et al.Tau as a biomarker of neurodegenerative diseases[J].Bio Med，2008,2(4):363-384.

[6]孫永明,鄭祖根,沈憶新.經顱外制作犬后腦缺血模型[J].中華實驗外科學雜志,1998,15(6):565.

[7]HIDEAKI W,HIDEKAZU T,AKIGUCHI I,et al.Axonal damage and demyelination in the white matter after chronic cerebral hypoperfusion in the rat[J].Brain Res,2002,924(1):63-70.

[8]TOMIMOTO H,IHARA M,WAKITA H,et al.Chronic cerebral hypoperfusion induces white matter lesions and loss of oligodendroglia with DNA fragmentation in the rat[J].Acta Neuropathol,2003,106(6):527-534.

[9]GABRIELLA M,CHRISTIAN Z,MUSCAT R,et al.Oligodendrocyte pathophysiology and treatment strategies in cerebral ischemia[J].CNS Neurosci Ther,2014,20(7):603-612.

[10]TAKAHASHI K,HASEGAWA S,MAEBA S,et al.Serum tau protein level serves as a predictive factor for neurological prognosis in neonatal asphyxia[J].Brain Dev,2014,36(8):670-675.

[11]RANDALL J,M?RTBERG E,PROVUNCHER G,et al.Tau proteins in serum predict neurological outcome after hypoxic brain injury from cardiac arrest:Results of a pilot study[J].Resuscitation,2013,84(3):351-356.

[12]TATEBAYASHI Y,HAQUE N,TUNG Y C,et al.Role of tau phosphorylation by glycogen synthase kinase-3beta in the regulation of organelle transport[J].J Cell Sci,2004,117(Pt9):1653-1663.

[13]IRVING E A,YATSUSHIRO K,MCCULLOCH J,et al.Rapid alteration of tau in oligodendrocytes after focal ischemic injury in the rat:involvement of free radicals[J].J Cereb Blood Flow Metab,1997,17(6):612-622.

[14]DAWSON M R，POLITO A,LEVINE J,et al.NG2-expressing glial progenitor cells:an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS[J].Mol Cell Neurosci,2003,24(2):476-488.

[15]AGUIRRE A,GALLO V.Postnatal neurogenesis and gliogenesis in the olfactory bulb fromNG2-expressing progenitors of the subventricular zone[J].J Neurosci,2004，24(46):10530-10541.

[16]VERONIKA S,BAUER N G,LISA S,et al.Downregulation of the microtubule associated protein Tau impairs process outgrowth and myelin basic protein mRNA transport in oligodendrocytes[J].Glia,2015,63(9):1621-1635.

[17]KURSULA P.Structural properties of proteins specific to the myelin sheath[J].Amino Acids,2008,34(2):175-185.

[18]JESERICH G,KLEMPAHN K,PFEIFFER M,et al.Features and functions of oligodendrocytes and myelin proteins of lower vertebrate species[J].J Mol Neurosci,2008,35(1):117-26.

[19]SEIBERLICH V,BAUER N G,SCHWARZ L,et al.Downregulation of the microtubule associated protein Tau impairs process outgrowth and myelin basic protein mRNA transport in oligodendrocytes[J].Glia,2015,3(9),1621-1635.