抗壞血酸對鈷納米粒子及鈷離子致成纖維細(xì)胞毒性的保護作用

洪鴻翔，朱 海，劉雅克，楊曉佑，吳雪飛，崔志明△，劉 璠

(1.江蘇省南通市第一人民醫(yī)院骨科 226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，江蘇南通 226001)

隨著金屬對金屬(metal-on-metal,MoM)髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的普及，其不良反應(yīng)漸漸引起人們的高度重視，如局部軟組織反應(yīng)及炎性假瘤等[1]。由鈷鉻合金制成的MoM髖關(guān)節(jié)置換植入物在體內(nèi)會釋放大量的金屬納米粒子及金屬離子[2]。鈷納米粒子(cobalt nanoparticles,CoNPs)是植入物降解產(chǎn)物的重要組成部分[3]。因此，鈷(CO)可能是導(dǎo)致MoM髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中不良反應(yīng)的主要原因。體外實驗已經(jīng)證明，CO2+可以導(dǎo)致氧化損傷、DNA損傷、炎癥反應(yīng)及有遺傳毒性作用[4]。有報道稱在體外實驗中碳化鎢-鈷(WC-CO)微粒可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。通過測定谷胱甘肽(GSH)水平的變化，可以發(fā)現(xiàn)與微粒相比，WC-CoNPs可以產(chǎn)生更高水平的活性氧(ROS)，從而產(chǎn)生更強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。進一步研究表明，在JB6細(xì)胞上，過氧化氫酶可以消除大量ROS，抑制WC-CoNPs誘導(dǎo)的線粒體膜通透性損傷[6]。抗壞血酸(ascorbic acid,AA)是一種常用的抗氧化劑，現(xiàn)已證實增加生理水平的AA可以抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平[7]。本實驗旨在探討CoNPs和Co2+對成纖維細(xì)胞的毒性作用機制，并使用AA降低CoNPs和Co2+所致的毒性反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料 Balb/3T3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。CoNPs，氯化鈷(COC1-2)和AA購于Sigma公司。抗體：細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF),Bcl-2、 Bax、Caspase 3、血紅素加氧酶1(HO-1)、β-actin購于美國Cell Signaling Technology公司，兔抗及鼠抗購自Sigma公司。Trizol總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購于Invitrogen公司，PCR引物購自Sigma公司，EDTA-Na2購于Life Sciences公司，細(xì)胞色素C試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技公司，GSH檢測試劑盒來自碧云天，CCK8試劑盒來自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2方法 將Balb/3T3細(xì)胞平均適量接種到96孔板中培養(yǎng)，每孔約100 μL。分別加入100 μL含有不同濃度藥液的培養(yǎng)基，分別處理12、24、48 h。加入CCK8試劑，酶標(biāo)儀450 nm波長測量。將細(xì)胞平均適量接種到6孔板中，分為如下6個組：對照組、Co2+組、Co2++AA組、CoNPs組、CoNPs+AA組、AA組。其中，加入H2O2的對照組為陽性對照組。首先用50 μmol/L AA提前預(yù)處理1 h，然后用50 μmol/L CoNPs和50 μmol/L Co2+分別再處理24 h。分別用CCK8檢測CoNPs、Co2+誘導(dǎo)及AA處理后的細(xì)胞毒性，使用細(xì)胞色素C試劑盒檢測從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的水平。采用熒光染色技術(shù)檢測線粒體中ROS生成，Western blot技術(shù)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)，實時定量PCR技術(shù)檢測mRNA水平的變化。所有檢測重復(fù)3次。

A、B、C：細(xì)胞分別被不同濃度Co2+和CoNPs處理4、24、48 h；D：各組細(xì)胞活性比較；1：對照組，2：CO2+組，3：CO2++AA組，4：CoNP組，5：CoNPs+AA組，6：AA組；a：P<0.05，與CoNPS組比較；b：P<0.05，與對照組比較

圖1 AA對Co2+和CoNPs處理過的Balb/3T3細(xì)胞的作用

2 結(jié) 果

2.1AA對細(xì)胞的保護作用 CoNPs和Co2+對細(xì)胞的毒性作用隨時間延長而增加，隨劑量加大而增加，具有時間和劑量依賴性，見圖1A、B、C。CoNPs誘導(dǎo)的毒性作用明顯強于Co2+。CoNPs和Co2+處理24 h后，其IC50值約為50 μmol/L。與CoNPs組比較，使用AA預(yù)處理可以明顯提高細(xì)胞的存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而AA預(yù)處理對Co2+處理的細(xì)胞存活率無明顯影響(圖1D)。

2.2AA對細(xì)胞內(nèi)ROS及HO-1生成的影響 結(jié)果顯示，CoNPs處理24 h可以明顯增加ROS的表達(dá)(P<0.05)；而使用AA預(yù)處理可以明顯減少CoNPs誘導(dǎo)的ROS生成(P<0.05)；Co2+可以輕微地增加ROS的水平，AA只輕微降低Co2+誘導(dǎo)的ROS水平(圖2A)。CoNPs可以明顯誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；使用AA預(yù)處理，可以明顯減少由CoNPs誘導(dǎo)的HO-1的表達(dá)(P<0.05)；而Co2+對HO-1表達(dá)無影響，見圖2B。

A:AA對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響；1：對照組；2：CO2+組；3：CO2++AA組；4：CONPS組；5：CONPS+AA組；6：H2O2處理陽性對照組；7：AA組；B:AA對細(xì)胞內(nèi)HO-1的影響，a：P<0.05，與對照組比較，b：P<0.05，與CoNPs組比較

圖2 AA對細(xì)胞內(nèi)ROS及HO-1生成的影響

2.3AA對細(xì)胞內(nèi)GSH生成及細(xì)胞色素C釋放的影響 CoNPs處理可以明顯減少GSH水平；AA預(yù)處理可以使CoNPs組GSH降低減弱(P<0.05)；而Co2+對GSH幾乎無影響(圖3A)。CoNPs和Co2+都可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放進入細(xì)胞質(zhì)中(P<0.05)；AA預(yù)處理可以抑制CoNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放(P<0.05)；而AA對Co2+無明顯作用，見圖3B。

A：AA對細(xì)胞內(nèi)GSH的影響；B：AA對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的影響；1：對照組；2：CO2+組；3：CO2++AA組；4：CONPS組；5：CONPS+AA組；6：AA組；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與CoNPs組比較

圖3 AA對細(xì)胞內(nèi)GSH生成及細(xì)胞色素C釋放的影響

圖4 Westem blot檢測細(xì)胞內(nèi)AIF、Bax等蛋白表達(dá)

2.4AA對細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及AIF、Caspases 3蛋白表達(dá)的影響 CoNPs和Co2+可明顯抑制抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)，其中CoNPs的抑制作用更明顯；使用AA預(yù)處理可抑制CoNPs對Bcl-2作用，但對Co2+的抑制作用無明顯影響。CoNPs和Co2+明顯誘導(dǎo)促凋亡因子Bax表達(dá)，且CoNPs的誘導(dǎo)作用更明顯；使用AA預(yù)處理后可降低CoNPs的誘導(dǎo)作用，但對Co2+無明顯影響。CoNPs和Co2+可明顯激活促凋亡Caspase家族表達(dá)，使其高表達(dá)，CoNPs的誘導(dǎo)作用更明顯；使用AA預(yù)處理可降低CoNPs的誘導(dǎo)作用，但是對Co2+的誘導(dǎo)作用無明顯影響。CoNPs可明顯誘導(dǎo)AIF表達(dá)；使用AA預(yù)處理可以明顯減少AIF的表達(dá)；Co2+對AIF的表達(dá)無明顯的影響，見圖4。

3 討 論

隨著MoM關(guān)節(jié)置換術(shù)應(yīng)用越來越多，由假體釋放的金屬納米粒子已成為潛在的健康威脅[1]。有報道稱MoM髖關(guān)節(jié)假體會導(dǎo)致患者不明原因的疼痛[8]，血液中金屬離子濃度超標(biāo)以及早期二次翻修率增高[9]。對假體組織檢測發(fā)現(xiàn)，金屬磨損物大多以CoCr納米粒子形式存在，且Co可能是不良反應(yīng)的主要原因[10]。

氧化應(yīng)激是納米粒子毒性作用的重要機制之一，且細(xì)胞內(nèi)ROS是評價納米粒子各種毒性作用的常用關(guān)鍵指標(biāo)[11]。GSH是一種重要的抗氧化劑，在保護細(xì)胞對抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用，GSH的損耗可以促進細(xì)胞內(nèi)ROS堆積及HO-1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。HO-1水平是衡量氧化應(yīng)激水平的代表性指標(biāo)[13]。通過熒光染色測量ROS發(fā)現(xiàn)，CoNPs使細(xì)胞中自由基表達(dá)更高，GSH水平下降，HO-1表達(dá)增加，導(dǎo)致更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。抗氧化劑AA是GSH的前體，可以抑制ROS生成，可部分緩解CoNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞各項指標(biāo)變化，減少細(xì)胞死亡，然而AA對Co2+引起的細(xì)胞指標(biāo)變化無作用。這表明由CoNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和ROS生成有關(guān)，AA能減少CoNPs誘導(dǎo)的死亡可能是通過減少了ROS的生成，而Co2+無明顯誘導(dǎo)ROS生成的作用。

有研究測量暴露于CO2+細(xì)胞胞內(nèi)AA水平，結(jié)果顯示其水平降低，且在人巨噬細(xì)胞暴露于CoNPs時，在細(xì)胞中補充或維持AA水平能明顯提高細(xì)胞活性[7]。據(jù)報道，當(dāng)金屬離子暴露于人支氣管上皮細(xì)胞(HAEo)中，額外補充生理水平的AA(100 μmol/L)可以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)AA鹽水平，轉(zhuǎn)化為類似于初始?xì)夤芑績?nèi)皮細(xì)胞，也能在內(nèi)皮細(xì)胞中預(yù)防CO2+毒性[14]。AA鹽可抑制氧化應(yīng)激相關(guān)的HO-1生成，同時降低涉及凋亡的Caspase家族活性[15]。這更進一步表明了AA的保護作用與ROS生成減少有密切的聯(lián)系。

已有研究表明CoNPs和Co2+都可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]，但其具體分子機制仍然不是很明確。哺乳動物細(xì)胞可以通過兩條信號級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)凋亡：內(nèi)源性途徑和外源性途徑。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥中扮演必不可少的角色。本研究中，CoNPs和Co2+都激活了Caspase 3，并且CoNPs的效應(yīng)高于Co2+，這表明CoNPs和Co2+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能通過外源性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。內(nèi)源性凋亡途徑主要通過氧化應(yīng)激和其他因子損傷線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞色素C和AIF從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)激活內(nèi)源性凋亡途徑[17]。AIF直接靶向于DNA破碎和染色質(zhì)凝結(jié)，是Caspase非依賴性凋亡途徑[18]，而細(xì)胞色素C以一種Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)CoNPs和Co2+都可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素C和AIF從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果表明CoNPs和Co2+激活了細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑。因此，CoNPs和Co2+可以同時激活內(nèi)源性和外源性凋亡途徑。

線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑受Bcl-2家族調(diào)控。Bcl-2家族蛋白通過調(diào)控促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡調(diào)控細(xì)胞生存或死亡[20]。在本研究中，CoNPs和Co2+都可以增加促凋亡因子Bax生成，減少抗凋亡因子Bcl-2生成，但是CoNPs的作用強于Co2+。

與Co2+相比，CoNPs導(dǎo)致更大幅度的GSH減少、HO-1增加和ROS高表達(dá)，而Co2+基本未改變這些指標(biāo)。這表明Co2+并未導(dǎo)致高濃度的ROS生成。盡管以往研究表明Co2+也會產(chǎn)生ROS，這個矛盾的結(jié)論可能是因為Co2+濃度不同、時間點不同及CO鹽的純度不同而造成[7]。在實驗中，盡管AA可以部分減少CoNPs的細(xì)胞毒性，但是它不能完全逆轉(zhuǎn)CoNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示CoNPs可能也通過其他非依賴ROS的凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這將有待進一步研究。

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