過表達miRNA-125b促進肺癌細胞A549的增殖、侵襲能力及其機制研究

張華勇，韓 強，李俏敏，鐘北龍

(中山大學附屬第五醫院：1.胸心外科；2.麻醉科，廣東珠海 519000)

近50年來許多國家都報道肺癌的發病率和病死率均明顯升高，肺癌已經是我國死亡率第1位的惡性腫瘤，嚴重危害人民群眾的身體健康[1]。肺癌患者早期診斷較為困難，故多數患者在就診時已經處于腫瘤中晚期，預后較差。微小RNA(microRNAs,miRNA)是一類小分子的非編碼單鏈RNA，長度為20～24個核苷酸，具有廣泛的生物功能：人類約1/3的基因的表達受miRNA調節，過程包括早期發育、細胞增殖、細胞凋亡及脂肪酸的代謝[2-3]。越來越多的研究證明miRNA與多種腫瘤的發生、發展具有密切的相關性，其中miRNA-125b在口腔癌及子宮內膜癌等腫瘤組織中明顯升高，并能通過多種機制影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲性[4-5]。但miRNA-125b與肺癌的相關性研究較少。作者旨在探討過表達miRNA-125b促進肺癌細胞A549的增殖、侵襲能力及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗細胞：正常人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)及人非小細胞肺癌(NSCLC)細胞A549購自上海天呈醫療科技股份有限公司。主要試劑及儀器：miRNA-125b模擬物、陰性對照(negative control,NC)模擬物購自上海伯豪生物技術有限公司，RPM2-1640培養液及胎牛血清購自美國Gibco公司，噻唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Gel DoxTM XR+凝膠成像系統購自美國Bio-RAD公司，Bcl-2 調節因子(BMF)及GAPDH抗體、BCA定量及Western blot試劑購自美國Invitrogen公司，RNA提取及PCR試劑購自瑞士Roche公司，PCR引物由寧波康貝生化有限公司合成(miRNA-125b上游引物：5′-GCU CCC UGA GAC CCU AAC-3′，下游引物：5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，下游引物：5′-GGG GTC GTT GAT GGC AAC A-3′)；超凈無菌工作臺購自德國Spetec公司，細胞培養箱購自美國Thermo公司，低速離心機購自美國Beckman Coulter公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標儀購自美國Biotek公司，PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 按3×105個/mL的密度將細胞懸液接種于96孔板培養，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養，待細胞面積生長至70%～80%后傳代。

1.2.2Q-PCR檢測HBECs及A549細胞的miRNA-125b表達水平 按照TrizolTM試劑盒說明書提取HBECs及A549細胞總RNA，測定RNA濃度及純度，取1 μg總RNA反轉錄合成cDNA，取5 μL cDNAxo稀釋4倍后，取2 μL為模板，分別以目的基因及內參GAPDH的引物進行Q-PCR，反應條件：95 ℃預變性3 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火/延伸30 s，重復 40個循環；65～95 ℃每增加0.5 ℃進行5 s讀板，形成溶解曲線。所有樣本均設置3個平行管，基因表達量以平行管平均循環閾值(cycle-threshold，Ct)表示，應用2-ΔΔCt法計算并比較兩種細胞miRNA-125b表達水平。

1.2.3細胞轉染 操作按照miRVanaTmmiRNA步驟進行：將轉染液以1∶30的比例加入RPM2-1640無血清培養基中混勻后靜置10 min，將miRNA-125b模擬物及NC模擬物分別加入混有轉染劑的培養基中混勻，靜置10 min后以反應生成復合體。將配置好的復合體鋪在96孔板并輕輕晃動，加入3×105個/mL的細胞懸液，混勻后置于培養箱中培養。將A549細胞分為3組：miRNA-125b組(加入miRNA-125b模擬物)，NC組(加入NC模擬物)及空白組(同等體積的混有轉染劑的胎牛血清)，采用Q-PCR檢測miRNA-125b的轉染及表達效率。

1.2.4MTT檢測細胞增殖能力 于細胞傳代后3、6、12、24、48 h采用MTT檢測A549細胞的增殖：各組細胞處理完后去除培養基，加入RPM2-1640培養液(每孔100 μL)及含0.5% MTT的培養液(每孔5 μL)，于37 ℃，5%CO2培養箱中孵育4 h后棄培養液，加入100 μL DMSO原液，振蕩10 min，待結晶完全溶解后用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(OD)值，實驗重復3次。

1.2.5Transwell小室細胞檢測細胞侵襲能力 采用小室法檢測細胞侵襲力：使用PBS將50 mg/L的Matrigel膠按照1∶8的比例稀釋后包被Transwell小室底部膜的上室面(每孔100 μL)，4 ℃風干后吸出殘存液體。按照每孔1×104的密度將3組A549細胞接種于處理好的上室中，在下室中加入500 μL 10%胎牛血清的培養基中培養24 h。用PBS洗去殘留培養基，4%的多聚甲醛固定過夜后洗去甲醛，HE染色后洗去染色液。侵襲能力評價依照過膜細胞數：在300倍鏡下選擇小室中央區域，隨機挑選5個視野并計數，求平均值。

1.2.6miRNA-125b靶基因檢測 采用targetscan(http://www.targetscan.org)根據3′-UTR預測miRNA-125b的靶基因為BMF，Western blot檢測3組A549細胞的BMF表達水平：按照說明書用蛋白裂解液(含磷酸酶抑制劑)裂解30～60 min，4 ℃，12 000×g離心5 min獲取總蛋白，BCA法測濃度后各取30 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V恒壓轉膜60～90 min；5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1～2 h，BMF(抗體1∶500)抗體4 ℃孵育過夜；1∶5 000 β-actin室溫孵育90 min，TBST洗膜10 min×3次，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×2次，TBS洗膜5 min，ECL發光試劑盒色，顯影，Gel DOXTM XR+凝膠成像系統成像，圖像分析采用QuantityOne軟件，取各條帶透光體積與內參條帶的比值作為目標蛋白相對表達量，實驗重復3次。

2 結 果

2.1HBECs及A549細胞miRNA-125b的表達水平比較 HBECs、A549細胞miRNA-125b的表達水平分別為1.0±0.1、2.7±0.4，與HBECs細胞比較，A549細胞的miRNA-125b表達水平明顯上升(t=5.925，P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與HBECs細胞比較

圖1兩種細胞的miRNA-125b表達水平

2.2各組A549細胞的miRNA-125b表達水平比較 與空白組(1.0±0.2)比較，miRNA-125b組細胞的miRNA-125b(2.9±0.6)表達水平上升(t=6.249，P<0.05)；NC組的miRNA-125b表達水平(1.0±0.1)無明顯變化(t=0.172，P>0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與空白組比較

圖2各組細胞的miRNA-125b表達水平

2.3各組A549細胞增殖能力比較 與空白組及NC組細胞比較，miRNA-125b組細胞的增殖能力明顯增加(P<0.05)；NC組與空白組細胞的增殖能力比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與空白組比較

圖3各組細胞的增殖能力比較

2.4各組A549細胞侵襲能力比較 空白組、miRNA-125b組、NC組過膜細胞數分別為(21.0±4.0)、(28.0±5.0)、(22.0±5.0)個。與空白組比較，miRNA-125b組細胞的侵襲能力上升(t=2.984，P<0.05)；NC組與空白組的侵襲能力比較，差異無統計學意義(t=0.357，P>0.05)。

2.5各組A549細胞的BMF表達水平 與空白組(1.0±0.1)比較，miRNA-125b組細胞的BMF(0.4±0.2)表達水平下降(t=5.921，P<0.05)；NC組的BMF(0.9±0.1)表達水平無明顯變化(t=0.285，P>0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與空白組比較

圖4各組細胞的BMF表達水平

3 討 論

目前，我國肺癌的發生率呈現逐年上升的趨勢，其中85%的患者為NSCLC。NSCLC的惡性程度較高，腫瘤進展較快，多數患者在確診時已經出現轉移，患者預后較差[6]。miRNA是一種內源性非編碼單鏈RNA分子，參與轉錄后基因表達調控。目前為止，動植物及病毒中已經發現有超過20 000個miRNA分子[7]。既往研究發現，多種疾病(心血管疾病、糖尿病及多種惡性腫瘤)患者存在異常的miRNA表達譜系，且miRNA在外周血中的存在較為穩定，多種miRNA在疾病診斷中的價值引起臨床上的關注。對miRNA生物學活性的深入了解，以miRNA作為疾病治療潛在靶點的研究已引起廣泛關注[8-9]。

miRNA-125b屬于miRNA-125家族，在不同生物學過程中發揮重要作用。miRNA-125b與腫瘤的發生、發展具有密切相關性，miRNA-125b在多種腫瘤組織中表達水平升高，本研究中，與HBECs相比，肺癌細胞A549的表達水平明顯上升。既往研究發現，化療失敗的的白血病患者的miRNA-125b水平明顯上升，而高表達的miRNA-125b能夠有效抑制多種化療藥物引起的白血病細胞凋亡，增強腫瘤細胞的耐藥性[10]；但miRNA-125b的過量表達后子宮內膜癌細胞的增殖能力下降，細胞周期停滯于G1期，細胞凋亡增加[11]。上述結果說明miRNA-125b的作用具有組織特異性，本研究旨在觀察miRNA-125b對肺癌細胞A549的增殖及侵襲能力的影響，并探討其機制。

本研究通過miRNA-125b模擬物轉染的方式構建miRNA-125b的高表達模型，經過轉染后，A549細胞的miRNA-125b表達水平明顯上調，細胞的增殖能力及侵襲能力增加。miRNA-125b調節細胞生物活性的機制較為復雜，既往研究發現BMF是miRNA-125b的潛在靶基因。BMF屬于Bcl-2家族，是常見的腫瘤促凋亡蛋白之一，人體BMF記憶位于15號染色體q14，在多種組織(腎臟、胰腺及造血系統等)中廣泛表達[12]。在正常細胞中，BMF與動力蛋白復合物結合，處于靜止狀態；BMF與動力蛋白復合物解離后參與線粒體途徑的細胞凋亡，BMF表達水平的下降或表達缺失導致細胞凋亡途徑受阻，細胞的增殖能力增加[13-14]。

既往研究發現，miRNA主要通過兩種機制調節靶向基因的表達：(1)miRNA與靶基因完全互補結合，切割靶基因的mRNA從而抑制其表達；(2)當miRNA與靶基因不完全互補時，miNAR主要抑制靶基因的翻譯過程，而不影響mRNA的穩定性[15]。部分miRNA可以通過上述兩種機制抑制靶基因的表達，而miRNA-125b對靶基因BMF的作用機制有待于進一步研究。

綜上所述，miRNA-125b能通過抑制BMF的表達促進肺癌細胞A549的增殖及侵襲。

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