巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子抗體對(duì)大鼠大腸異常隱窩病灶及大腸癌的影響

沈媛媛，劉成霞，王愛麗，程 凱，張冉冉

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.甲狀腺乳腺外科，山東濱州 256600)

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，早期發(fā)現(xiàn)大腸癌前病變是提高大腸癌治愈率的關(guān)鍵。異常隱窩病灶(aberrant crypt foci，ACF)是目前顯微鏡下可見的最小、最早的癌前病變[1]，ACF數(shù)量與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生有明顯相關(guān)性[2]。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)及治療ACF成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)作為一種傳統(tǒng)的炎性因子，可直接影響細(xì)胞的分裂和誘導(dǎo)癌基因的惡性轉(zhuǎn)化，是一個(gè)獨(dú)特的促腫瘤發(fā)生細(xì)胞因子[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用二甲基肼誘導(dǎo)大鼠ACF及大腸癌模型，在組織學(xué)水平探討MIF的表達(dá)及MIF抗體對(duì)ACF及癌瘤數(shù)量的影響，分析MIF抗體在大腸癌癌變中的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠100只，雌雄各半，5周齡左右，平均體質(zhì)量70 g左右，購(gòu)自山東魯抗公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK魯20130001。嚴(yán)格按照濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的條例執(zhí)行。主要藥物及試劑：二甲基肼、MIF抗體均由濟(jì)南芯博生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)D161802、20415-1-AP。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 所有大鼠在溫度24 ℃、濕度50%左右的條件下飼養(yǎng)，喂以常規(guī)飼料，適應(yīng)1周后，將其分為5組，每組20只。空白組(A組)：每周腹腔內(nèi)注射生理鹽水1 mL/100 g。參照賈旭東等[5]方法建立動(dòng)物模型，ACF對(duì)照組(B組)：腹腔注射二甲基肼25 mg/kg及生理鹽水1 mL/100 g，每周1次，連續(xù)12周；MIF抗體治療ACF組(C組)：腹腔注射二甲基肼25 mg/kg+生理鹽水1 mL/100 g+MIF抗體400 μg/只，連續(xù)12周；大腸癌對(duì)照組(D組)：腹腔注射二甲基肼25 mg/kg及生理鹽水1 mL/100 g，每周1次，連續(xù)20周后；MIF抗體治療大腸癌組(E組)：腹腔注射二甲基肼25 mg/kg+生理鹽水1 mL/100g + MIF抗體400 μg/只，連續(xù)20周。以上大鼠每周稱體質(zhì)量1次，并根據(jù)體質(zhì)量改變生理鹽水、二甲基肼劑量。

1.2.2大鼠ACF檢查 實(shí)驗(yàn)第13周，選取A組大鼠10只及B、C組全部(n=20)大鼠用于ACF檢查。10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血后斷頭處死大鼠，快速分離大腸并切下，參照BIRD[6]的方法固定標(biāo)本和染色，用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，將整根大腸鋪平夾于兩層濾紙之間，固定于100 mL/L中性緩沖甲醛溶液中，至少24 h。固定好的標(biāo)本用2 g/L亞甲藍(lán)染色3～5 min，立即在×40光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)ACF數(shù)目。比較A、B、C 3組ACF數(shù)目變化。

1.2.3大鼠大腸癌檢查 實(shí)驗(yàn)第21周，將A組剩余10只大鼠及D、E組全部(n=20)大鼠用10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血后斷頭處死，快速分離大腸并切下，縱向剖開，用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，展開鋪于玻璃板上，計(jì)算每只大鼠大腸腫瘤數(shù)目，最后用中性緩沖甲醛溶液固定。固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋并5 mm切片，每組選取2張進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2.4ELISA及免疫組化檢測(cè) 將各組血標(biāo)本離心并取血液上清液，凍存于-80 ℃冰箱備用。在進(jìn)行ELISA前將各組血液上清液復(fù)溫，并按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)MIF。將各組石蠟標(biāo)本5 mm切片后，隨機(jī)選取2張進(jìn)行MIF免疫組化染色，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。以已知陽性結(jié)果作為陽性對(duì)照，PBS液作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1MIF抗體對(duì)大鼠ACF的形成及大腸癌發(fā)生的影響 實(shí)驗(yàn)第13周，處死A組10只大鼠的大腸中無ACF形成，B、C組大鼠的大腸中均有ACF形成(圖1A)；B、C組大鼠的大腸ACF總數(shù)量分別為(115.20±14.12)、(52.40±7.35)個(gè)，C組的抑制率為54.50%，C組每只大鼠的大腸ACF總數(shù)量明顯低于B組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第21周，處死A組10只大鼠的大腸中無大腸癌發(fā)生，D、E組大鼠的大腸中均有大腸癌形成(圖1B);D組大鼠癌瘤總數(shù)目為27個(gè)，E組為14個(gè)；E組的抑制率為48.10%，與D組比較，E組的大鼠大腸癌發(fā)生率明顯受抑制(P<0.01)。

A:ACF;B:大腸癌

圖1大鼠ACF及大腸癌形成HE染色(×40)

2.2MIF抗體對(duì)大鼠大腸癌癌變過程中MIF表達(dá)的影響 ELISA檢測(cè)各組血清MIF表達(dá)水平，A、B、C、D、E組分別為(1.60±0.30)、(20.10±4.80)、(12.70±3.60)、(78.00±7.50)、(51.20±8.50)pg/mL；與A組比較，B、C、D、E組大鼠血清MIF表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；B組MIF水平明顯高于C組(P<0.01)，D組MIF水平明顯高于E組(P<0.01)，D組MIF水平明顯高于B組(P<0.01)。免疫組化法檢測(cè)各組MIF表達(dá)，實(shí)驗(yàn)第13周，MIF在B、C組均有表達(dá)(圖2A、B)，且C組可明顯抑制MIF表達(dá)；實(shí)驗(yàn)第21周，D組呈高表達(dá)(圖2C)，E組可明顯抑制MIF表達(dá)(圖2D)，MIF在A組不表達(dá)(圖2E)。

A：B組；B:C組；C:D組；D:E組；E:A組

圖2免疫組化法檢測(cè)各組大鼠MIF表達(dá)

3 討 論

二甲基肼是一類經(jīng)典的嚙齒類致癌劑，在細(xì)胞、組織水平變化及腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制方面與人類大腸癌癌變過程類似[7]；自1987年BIRD[6]利用實(shí)體鏡在大腸癌動(dòng)物模型中首次發(fā)現(xiàn)了ACF，在隨后一系列臨床及動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，ACF是大腸癌發(fā)病路徑中，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)的最早的黏膜損傷，它的出現(xiàn)明顯早于不典型增生及腺瘤，并在遺傳、表觀遺傳、免疫組化和組織病理等方面的改變影響著腫瘤的發(fā)生，且ACF的數(shù)量與結(jié)直腸高危腫瘤[即直徑1 cm及以上和(或)絨毛狀、和(或)重度不典型增生、浸潤(rùn)癌]的發(fā)生有明顯的相關(guān)性，因此它被稱為最早的大腸癌前病變[8-9]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了二甲基肼可誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠最早期癌前病變大腸ACF，并隨用藥時(shí)間增加建立大鼠大腸癌模型，這說明在大鼠大腸癌癌變過程中，ACF是目前最早發(fā)生的、顯微鏡下可見的最小的癌前病變，通過檢測(cè)ACF數(shù)量可評(píng)價(jià)大腸癌癌變概率。

大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多途徑過程，目前，越來越多的研究集中于腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響。MIF是1966年由BLOOM等[10]發(fā)現(xiàn)的一種淋巴因子，因其能減慢或抑制巨噬細(xì)胞的隨機(jī)移動(dòng)而得名，有激素樣抗炎、免疫耐受的作用[11]，近年來，發(fā)現(xiàn)MIF在結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中的高表達(dá)，并通過信號(hào)通路CD74/CD44受體結(jié)合來活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)ERK1/2 MAPK信號(hào)途徑[12]，并與CXCR2和CXCR4結(jié)合，抑制抑癌基因p53功能[3]，發(fā)揮其在腫瘤增殖、分化等方面的作用。在大腸癌的相關(guān)研究中，目前已發(fā)現(xiàn)，向C26荷瘤小鼠注射抗MIF抗體后，可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]；在人正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織及相應(yīng)患者的血清中，MIF的表達(dá)依次增加，且與大腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。因此，以MIF抗體作為大腸癌預(yù)防、治療、防治轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷有著潛在的發(fā)展前景[15]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MIF抗體可以明顯抑制ACF及大腸癌癌瘤數(shù)量，即在組織水平上說明了MIF抗體在大鼠從大腸癌早期癌至癌瘤形成的過程中發(fā)揮抑制作用。通過免疫組化和ELISA發(fā)現(xiàn)，大腸癌腸黏膜中MIF的表達(dá)明顯高于早期癌變ACF模型腸黏膜的MIF表達(dá)，在一定意義上說明MIF參與了大腸癌癌變過程，應(yīng)用MIF抗體后可明顯抑制ACF和大腸癌模型中MIF的表達(dá)，在蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)了MIF抗體在大腸癌癌變過程中的抑制作用。

綜上所述，應(yīng)用MIF抗體后能明顯抑制ACF數(shù)量及大腸癌瘤體體積，并抑制MIF在血清及組織中的表達(dá)，這可能是MIF抗體能阻斷大腸癌癌變的作用機(jī)制，在今后的研究中，需要在分子水平等方面進(jìn)一步深入研究MIF抗體的作用機(jī)制，MIF可能會(huì)成為大腸癌早診早治的新靶點(diǎn)。

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